一、神经干细胞分化前后基因表达变化的DNA微阵列分析（论文文献综述）
杜国强[1]（2020）在《MiR-140-5P在小儿先天性巨结肠发病机制中的研究》文中研究表明研究背景先天性巨结肠病（Hirschsprung,s disease,HSCR）被称之为肠道无神经节细胞症,它是由于胚胎期肠神经嵴细胞发育障碍造成的肠畸形,同时也是一种多基因缺陷遗传病,在小儿先天性肠管动力障碍疾病中属于最常见的类型。先天性巨结肠病具有一定的遗传倾向,据统计,其发病率大约占到新生儿活胎的1/4000-5000,在比例上,男:女约为4:1。现有研究将HSCR的发病归因于患儿胚胎发育进程的异常。在胚胎神经发育的初期,某些物质干预肠神经嵴细胞（the enteric neural crest cells,ENCCs）在分化、迁移、定植的过程,从而使肠神经系统发育迟缓甚至停滞,进而病变肠道的粘膜下和肌内层神经节细胞呈现不同长度或程度的缺失,相关受累及的肠段出现异常收缩导致狭窄,受累肠管近端结肠出现梗阻性扩张,并逐渐肥厚,最终形成此病。先天性巨结肠临床表现为难治性排便困难和腹胀等下消化道梗阻症状,是一种严重影响小儿健康的先天性肠道系统疾病。由于导致先天性巨结肠的原因以及其发病机制仍未明确,保守治疗效果欠佳,所以手术治疗仍然是目前根治小儿先天性巨结肠的最佳方法。该病常发生于婴幼儿时期,手术创伤较大,风险较高,术后容易出现并发症,这不仅给术后管理带来困难,而且使得患儿未来的生活质量受到严重影响。所以目前除了手术治疗之外,能否发现其他根治先天性巨结肠的治疗方法,是近年来许多学者研究的重点和难点。根据目前的研究和总结,我们发现小儿先天性巨结肠是有诸多因素综合作用所导致,其中诸因素中最为重要是遗传因素。近年来,HSCR的基因研究受到众多研究者青睐,并初具成效。大量的研究结果表明HSCR患儿存在多种基因和信号通路的表达异常。目前为止,研究者通过分子生物学实验及遗传学分析,发现了许多和HSCR发病相关的基因,例如:内皮素B受体（endothelin B receptor,EDNRB）、原癌基因RET、内皮素3（endothelin3,EDN3）、内皮素转换酶1（endothelin converting enzyme 1,ECE1）、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、神经营养蛋白（neurturin,NTN）、SEMA3C、SEMA3D、NRTN、SOX10、TCF4、Phox2B、KIAA1279、SIP1（smad2 interacting proteinl）、NRG1、GFRα 1、PSPN、ZFHX1B及L1CAM等。这些基因大多可直接或间接的作用于机体内相关的信号通路,从而进一步干扰肠管神经崤干细胞的分化、迁移及增殖。这些过程出现障碍即是肠管神经嵴干细胞定植于肠道,形成先天性巨结肠的根本原因。miRNAs（microRNA,微小RNA）作为一类内源性RNA,分子很小,仅由19-23个核苷酸构成的。这种非编码单链小分子RNA是以碱基对配对的方式与其自身靶基因mRNA分子的3’ UTR区即3’非编码区结合,这种特异性的结合引发了靶基因mRNA的翻译抑制（不完全结合）或降解（完全结合）,从基因层面上影响调控转录后翻译水平的基因表达。目前的大量研究已发现,miRNAs基因量多,表达丰富,在多种生命过程中,其中包括各种细胞的增殖与调亡、个体器官的发育、系统功能的维持、多种应激反应及许多疾病的发病等,都发挥着非常重要的作用。已经证实了神经系统的发育与miRNA密切相关,因此,肠神经系统的发育也很可能和miRNA的基因调控作用有关联。通过目前的一些研究,已经发现miRNAs参与调控了肠神经嵴干细胞的分化、迁移、增殖和调亡的一系列基因表达过程,其和HSCR（先天性巨结肠）的发病相关。研究者对此进行了研究分析发现,HSCR患者的狭窄段肠管组织中的确存在着多种miRNAs的异常表达,如:MiR-200a、MiR-141、miR-939、miR-195、miR-218-1、miR-150-5p、miR-124及miR-206 等。在HSCR患者的狭窄段肠管组织中,这些miRNAs有些表达升高,有些表达降低,一般均通过与相应的靶基因结合,在基因水平上参与了先天性巨结肠的发病过程。但由于目前miRNAs在小儿巨结肠中的研究仍不足,很多研究还处于初级阶段。这种先天性疾病的发病机制仍需要大量的研究去阐明。为了进一步探索miRNAs在该病发病机制中的作用,我们需要集中先天性巨结肠组织中的miRNAs,建立表达谱,筛选出其中一些特异性的miRNA,应用现有的基因技术,进行深入研究。在技术层面上,众多研究者目前广泛采用的是miRNA基因芯片技术。由于这种技术具有的高特异性和高灵敏度的优点,因此被认为是一种理想的高通量检测方法,在实际使用中效果非常好。本课题中,我们也采取了这种检测技术。我们利用该技术对切除的病变肠管扩张段与狭窄段肠管组织中差异表达的miRNAs进行甄别、归类、初筛,并建立miRNAs表达谱,从而初步对小儿HSCR病变肠管组织的miRNAs表达谱有大体基本的了解。按照惯例我们把Fold Change≥2且p<0.05定为对miRNA表达有显着性差异的判断标准。通过对miRNAs基因芯片筛选,在一些小儿先天性巨结肠病变肠管组织（扩张段和狭窄段）中很可能存在异常表达的miRNAs,这些结果很可能存在假阳性,所以需要我们进一步去筛选这些miRNAs,接下来我们通过qRT-PCR验证,并将其与miRNA基因芯片筛选进行比对,获得相同的miRNA。选定我们要研究的miRNA后,首先,我们将进行一系列的体外细胞学实验去探索我们选定的miRNA在先天性巨结肠发病中的作用;然后,我们将通过生物信息学进行靶基因预测并进行相关的实验进行验证;最后,我们会对此miRNA导致HSCR发病的相关信号通路进行相应的研究。材料和方法材料:收集在山东省立医院就诊并手术的32例散发性先天性巨结肠患儿的肠狭窄段及扩张段手术标本,其中男22例,女10例;年龄4月-5岁。经术前钡造影、直肠肛管测压、病理结果证实。4例进行芯片检测,28例进行扩大样本量验证。方法:1、利用miRNAs基因芯片（芯片由上海康成生物科技有限公司提供）进行筛选,发现差异表达的miRNA,miRNAs表达有显着性差异判断标准为FoldChange ≥2 且 p<0.05。2、通过对HSCR组织miRNA基因芯片扫描结果进行筛选及分析,最终选出目前尚未报道而且和神经发育关系比较密切的miR-140-5p作为研究对象,并进一步行qRT-PCR验证。3、选取SH-SY5Y细胞（人神经母细胞瘤细胞）和293T细胞（人肾上皮细胞）进行体外细胞学实验。慢病毒干扰下调SH-SY5Y和293T细胞中miR-140-5p的表达,将其分为阴性对照组、病毒空转组、miR-140-5p敲除组。qRT-PCR检测细胞转染的效率高低;CCK-8实验检测各组细胞转染后的增殖能力变化;Transwell细胞迁移实验及划痕实验检测敲除miR-140-5p后,各组细胞迁移能力变化的影响;Western blotting检测miR-140-5p敲除后调亡及自噬相关的蛋白（Bax、Beclin-2、cleaved-caspase-3、pro-caspase-3、cleaved-parp-1）的表达情况;流式细胞仪用于检测细胞凋亡情况并记录其变化;4、运用生物信息学软件进行预测miR-140-5p的靶基因为EGR2,并进一步验证在先天性巨结肠中miR-140-5p是通过调控EGR2发挥作用。5、Western blotting、免疫组化及免疫荧光检测先天性巨结肠病变肠管组织与正常肠管组织中EGR2的相对表达情况;Western blotting检测EGR2在各组细胞中的表达情况;6、Western blotting检测AKT信号通路相关蛋白（p-AKT、AKT）的表达情况,并进行相关实验分析AKT信号通路在HSCR发病中的作用。7、统计学方法:采用SPSS19.0（SPSS公司,芝加哥,USA）统计软件。本课题实验数据均采用t检验（Student’s t-test）、x 2检验或Fisher精确法进行统计学分析,P<0.05为差异具有统计学意义。结果一、小儿巨结肠狭窄段及扩张段miRNA基因芯片检测结果通过基因芯片检测结果表明:与扩张段组织相比,狭窄段组织中有40种差异表达miRNA（显着性差异判断标准为Fold Change≥2且p<0.05。）,其中24 种 miRNA 高表达,比如:miRNA-483-5P、miRNA-218-1、miRNA-195、miRNA-124、miRNA-25、miRNA-133a等,具体结果见表1-1;16种miRNA低表达,比如:miRNA-141-3P、miRNA-373-5P、miRNA-9-5P、miRNA-140-5P 等,差异存在统计学意义（P<0.05）,数据总结见表1-2。选取下调miRNA中差异表达明显、目前尚未报道而且和神经发育关系比较密切的miR-140-5p作为研究对象。qRT-PCR扩大样本验证miR-140-5p在小儿巨结肠狭窄段组织中呈低表达,和miRNA基因芯片结果一致。二、体外细胞学实验及相关功能学试验验证1.CCK8试验表明miR-140-5p的下调降低了细胞的增殖能力;Western blotting检测凋亡相关蛋白结果显示miR-140-5p的下调促进细胞凋亡;流式细胞结果表明miR-140-5p的下调促进了 SH-SY5Y和293T的凋亡;划痕实验表明miR-140-5p的下调导致细胞迁移能力的下降;而Transwell实验结果进一步表明miR-140-5p的下调降低了细胞的迁移能力。2.运用靶基因预测软件Targetscans预测miR-140-5p作用于巨结肠的靶基因可能为EGR2。双荧光素酶实验证明miR-140-5p可以对EGR2的3’ UTR起到抑制性调控作用。共转染实验证明,在HSCR中,miR-140-5p通过调控靶基因EGR2发挥作用。3.Western blotting、免疫组化及免疫荧光实验结果显示EGR2在狭窄段肠管组织中的表达水平显着上调;miR-140-5p表达与EGR2呈现明显的负相关,SH-SY5Y和293T在敲低miR-140-5p后EGR2的表达明显升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。4.Western blotting 结果显示 SH-SY5Y 和 293T 在敲除 miR-140-5p 后,信号通路相关蛋白P-AKT下调,使用Akt通路激活剂SC79后,细胞的生物学行为得到恢复。提示下调miR-140-5p可能通过其靶基因EGR2抑制AKT信号通路,进而抑制SH-SY5Y和293T的增殖、迁移能力,同时促进其凋亡。说明miR-140-5p能够利用Akt信号通路参与HSCR发病。结论1、先天性巨结肠狭窄段肠管和扩张段肠管存在miRNA表达差异,多种miRNAs参与了小儿先天性巨结肠的发生、发展,有待于进一步研究。2、MiR-140-5p在小儿先天性巨结肠狭窄段组织中下调,抑制肠神经嵴干细胞在肠道的增殖、迁移及分化,诱导凋亡,促使HSCR在胚胎早期的发生发展。3、MiR-140-5p可能通过调控其靶基因EGR2抑制AKT信号通路参与HSCR的发病机制。
李霁敏[2]（2014）在《两种中医治法对脑缺血再灌注大鼠神经干细胞增殖分化wnt/β-catenin信号转导通路基因及差异蛋白表达的影响》文中提出目的：本实验基于“肾精和脑髓”藏象理论与缺血性脑卒中“气虚血瘀”病机理论，应用新安名老中医经验治法益气活血法和补肾生髓法及其代表中药复方，研究局灶性脑缺血再灌注大鼠脑内源性神经干细胞增殖分化Wnt/β-catenin信号通路变化及其调控机制,部分揭示“肾精和脑髓”藏象理论及“气虚血瘀”病机理论物质基础与调控的生物学机制及“补肾生髓法”与“益气活血法”的作用机制，为中风的治疗和康复技术开发以及药物的研究思路与方法提供实验依据。方法：健康雄性SD大鼠136只，随机分为正常组，模型组，补肾生髓法组，益气活血法组，每组又分为再灌注3d、7d2组，每组17只。根据Zea Longa法加以改进建立MCAO/R动物模型。实验一选取大鼠新鲜缺血侧额顶叶皮质，采用基因芯片技术分别检测3d组和7d组MCAO/R大鼠缺血侧额顶叶皮质wnt/β-catenin信号通路基因表达的变化，用ΔΔCt统计方法分析结果。实验二选取大鼠内固定的脑组织，做脑部冠状切片，采用免疫组织化学二步法测定大鼠脑皮质wnt7a和mmp7蛋白的表达，用图像分析系统和SPSS17.0软件处理，两组之间比较用t检验分析结果。结果：1实验一结果基因芯片检测结果显示再灌注3d、7d，MCAO/R大鼠缺血侧脑皮质wnt/β-catenin信号转导通路上的多个基因表达发生变化，3d组模型与正常比较，下调基因有TCF3,wnt10a, wnt2, wnt7a, wnt9a，7d组模型与正常比较，上调基因有Mmp7, Wnt3a，下调基因有vangl2, DKK1, fzd2, myc,nkd1,sfrp5,wisp1, wnt7a。经益气活血方和补肾生髓方干预后，wnt/β-catenin信号转导通路上的不同功能多个基因发生上调下调的变化，3d益气活血组与模型组比较，上调基因有wnt7a；3d补肾生髓组与模型组比较，上调基因有RGD1561440,TCF3,wnt1,wnt7a,wnt9a,wnt9b；3d益气活血组与补肾生髓组比较，上调基因有Gsk3a,sfrp1,wnt9a,下调基因有wnt7b。7d益气活血组与模型组比较，上调基因有wnt2，下调基因有Fzd9, Mitf, Mmp7, Wnt1；7d补肾生髓组与模型组比较，上调基因有Vangl2,Sfrp2, Tle1, Wnt7b,下调基因有Cby1, Wnt8b, Actb；7d益气活血组与补肾生髓组比较，上调基因有Dkk3, Mmp7,RGDC，下调基因有Wnt8b,Wnt9a。并且再灌注7d时的基因变化数量比再灌注3d时增多。2实验二结果免疫组织化学实验结果显示，与3d正常组比较，3d模型组wnt7a、mmp7阳性面积和平均光密度明显增加（P<0.01，P<0.05或P<0.01，P<0.01）；与模型组3d比较，3d益气活血组wnt7a、mmp7阳性面积和平均光密度显着增加（P<0.01，P<0.01或P<0.05，P<0.05）；与模型组3d比较，3d补肾生髓组wnt7a平均光密度值增加（P<0.05），阳性面积增加无统计学意义（P>0.05），mmp7阳性面积和平均光密度增加（P<0.05，P<0.05）；3d益气活血组与3d补肾生髓组比较，wnt7a阳性面积增加（P<0.01），平均光密度值增加无统计学意义（P>0.05），mmp7表达的阳性面积和平均光密度值差异不明显（P>0.05，P>0.05）。与正常组7d比较，7d模型组wnt7a、mmp7阳性面积和平均光密度增加（P<0.05，P<0.05或P<0.01，P<0.01）；与模型组7d比较，7d益气活血组wnt7a、mmp7阳性面积和平均光密度增加（P<0.05，P<0.05或P<0.01，P<0.01）；与模型组7d比较，7d补肾生髓组wnt7a平均光密度值增加（P<0.05），阳性面积增加无统计学意义（P>0.05），mmp7阳性面积和平均光密度值增加（P<0.05，P<0.05）；7d益气活血组与7d补肾生髓组比较，wnt7a阳性面积增加（P<0.05），平均光密度值增加无统计学意义（P>0.05），mmp7表达的阳性面积和平均光密度值增加（P<0.05，P<0.05）。益气活血组和补肾生髓组均能不同程度增加wnt7a的表达，降低mmp7的表达，但是在不同灌注时间段两组复方对指标的影响存在差异。结论：课题组在前期开展了一系列益气活血法和补肾生髓法防治缺血性脑卒中的理论和实验研究，论证了两种治法可以参与到脑缺血后炎症反应、凝血纤溶系统、细胞凋亡、神经可塑性等多个方面发挥脑保护的作用，并最终可促进神经干细胞的增殖分化。本实验研究在前期工作的基础上，发现益气活血方组、补肾生髓方组在再灌注两个时间点能使Wnt/β-catenin信号转导通路的多个基因表达发生变化，上调基因以wnt配体，转录因子，调控神经、血管和细胞发育分化的基因为主，下调基因以β-catenin摧毁器组分、拮抗因子、降解细胞外基质基因以及与细胞周期和凋亡相关的基因为主。并且两种中药复方能增强脑缺血侧额顶叶皮质wnt7a的表达，降低mmp7表达，但在不同灌注时间点存在差异。免疫组织化学的实验结果与PCR芯片的结果基本吻合，两种复方可能通过调节wnt7a和mmp7的表达，调控Wnt/β-catenin信号转导通路的功能，促进局灶性脑缺血再灌注后内源性神经干细胞（neural stem cells,NSCs）的增殖分化。
葛丹[3]（2013）在《NSCs三维培养及其微流控动态模型的构建》文中研究指明神经干细胞（Neural stem cells, NSCs）是一类能够自我更新,并具有多向分化潜能的细胞。它的发现为深入研究神经系统的发育、神经退行性疾病治疗以及受损神经组织的临床移植带来新的希望。而要实现NSCs的各种潜能则必须对其各种生理生化特性有正确的认识与了解。因此,体外构建与体内微环境相似的NSCs模型是深入研究NSCs各种生理机制的重要方法与手段,已成为神经科学与神经组织工程研究领域的热点。传统的NSCs体外细胞模型主要采用的是二维单层贴壁培养法和“神经球”悬浮培养法,细胞无法真正体现其在体内的生物学特性与功能。而以生物支架为基础的细胞三维培养则被认为更加接近哺乳动物体内真实微环境,已经成为体外研究NSCs增殖与分化机制、药物及环境毒素筛选与评价以及构建神经组织替代物的首选模型。目前,体外构建NSCs三维类神经组织的研究,在国内外还处于实验探索阶段,没有标准化的实验方法。因此,本文主要在NSCs体外三维培养方式及其生长与分化调控方面,开展了以下工作：（1）获取原代小鼠NSCs（mNSCs）并对其加以鉴定。通过原代培养方法从孕龄14d的昆明种小鼠胎脑的海马组织中获得mNSCs,考察了5个不同的接种密度对mNSCs生长趋势、所形成的“神经球”大小的分布以及扩增倍数的影响。最终确定了原代mNSCs的最佳接种密度为1×105cells/mL。传代培养的mNSCs能够稳定表达NSCs特征蛋白（Nestin和Sox2）,经10%胎牛血清诱导能够分化成神经元（β-tubulin-Ⅲ阳性）、星形胶质细胞（GFAP阳性）以及少突胶质细胞（O1阳性）,表明本实验分离获得的mNSCs具有自我更新与多向分化潜能。（2）筛选并确定一种促进nNSCs体外扩增的无血清培养基MA。三维模型需要足够的细胞数量,因此本研究采用正交试验筛选并确定了能够提高mNSCs扩增倍数的培养基添加组分及其浓度与比例,MA显着地促进了mNSCs的增殖,细胞在对数增长期的最大密度可达到（7.25±0.23）×105cells/mL （p<0.01）,是初始接种密度（（1.0±0.1）×105cells/mL）的7.25倍。同时,免疫荧光染色显示,MA培养的mNSCs其Nestin的阳性表达率为94.2±3.5%,说明优化后的培养基能很好地维持mNSCs的干细胞特性。同时,实验结果显示,MA中葡萄糖/谷氨酰胺配比对mNSCs生长有良好的促进作用,进一步确定了MA是一种适用于mNSCs体外扩增的新型优良培养基。（3）提出一种基于两步培养的体外构建mNSCs三维静态模型的实验方法。该方法以0.5mg/mL的Ⅰ型胶原水凝胶为支架材料,采用两步培养法模拟体内神经发生的不同阶段的生理微环境。培养初期采用添加了EGF/bFGF/BSA/Lipids的DMEM/F12/RPMI-1640的促mNSCs增殖的培养基MA,待细胞形成直径至50-100μm左右的团簇时,将培养基MA更换为含有bFGF和BDNF生长因子的NB/B27条件培养基（MC）。团簇中的细胞开始沿着支架迁移,直到彼此相连形成神经组织样结构。此构建物内细胞生长状态良好且分布均匀,活率在82%左右,14.17±2.62%细胞仍保持mNSCs特性,而神经元比率为40.93±1.85%,星形胶质细胞比率为27.13±1.63%。（4）建立了一种基于微流控技术的NSCs三维动态培养方法。mNSCs三维培养技术与微流控技术相结合,设计并建立了一套适合nNSCs三维生长的微柱阵列式微流体芯片培养系统。实现了以胶原水凝胶为支架材料的mNSCs三维复合物在微流体芯片上的构建与生长。结果显示,利用静态培养条件下建立的两步法在芯片上构建的mNSCs三维复合物中有NSCs特征蛋白Nestin的表达,同时具备分化成神经元和星形胶质细胞的能力；对一个培养周期内的细胞代谢产物进行取样分析,芯片三维培养体系中乳酸的浓度始终稳定在1.0mmol/mL以内,谷氨酰胺浓度维持在2.0mmol/mL左右,为mNSCs的生长提供一个稳定的生长环境；而三维静态培养条件下乳酸浓度随着半量换液在2.5～4.5mmol/mL间波动,谷氨酰胺浓度也会随着培养时间不断消耗需要人工补加。这种两步法构建芯片式mNSCs三维模型,操作简便,重复性好,成功率高。便于倒置显微镜下观测,有望成为新型药物筛选或环境毒素监测的神经组织替代物。
陈小玉[4]（2013）在《白脉散有效成分组调控神经干细胞增殖的分子机制研究》文中指出目的:脑卒中（Stroke）作为一种发病突然、病因复杂的神经系统疾病,具有高发病率、高致死率、高致残率等特点,其中脑卒中神经病变（stroke neuropathy,SN）的治疗康复属临床医学难题。目前,临床治疗脑卒中药物的有效性较差,且早期溶栓治疗的时间窗的把握比较困难,因此康复治疗SN显得尤为重要。神经干细胞（Neural Stem Cells,NSCs）作为一类未分化前体细胞,在成年哺乳动物神经系统中仍保留自我增殖分化的生物学特性,能够分化为神经元和胶质细胞。因此利用NSCs填补神经元缺失成为抗SN治疗的新策略。由于其良好的治疗前景,研究利用药物调控内源性NSCs的增殖分化,从而达到治疗SN的目的具有意义重大。目前,国内外研究多围绕信号通路、细胞因子对NSCs的调控等方面展开,但对民族药物调控NSCs增殖治疗SN的药理学机制研究较少。前期研究表明蒙药“白脉散”及其有效成分组具有抗氧化、抑制神经元凋亡和抗SN的作用,但对于NSCs的调控及机制研究仍是空白。本实验以“有效成分组学”理论为指导,建立体内外NSCs缺氧损伤模型,从促进NSCs增殖的角度验证BMECG的神经保护功能,并对其分子机制进行初步探索研究,探讨BMECG作为民族药大复方治疗SN的应用潜力,为民族药物的的研究和开发提供新思路。方法:1.采用悬浮培养法,培养大鼠大脑皮层NSCs。对所培养的NSCs进行增殖率以及针对NSCs标志性蛋白Nestin的免疫荧光检测;针对神经元标志性蛋白MAP-2,对获得的NSCs进行体外诱导分化能力的免疫荧光鉴定;在显微镜下,对培养及分化的NSCs进行形态学观察。建立原代NSCs缺糖缺氧复供（OGD/R）损伤模型,将纯化的NSCs分为正常组、模型组、阳性药组、BMECG高、中、低剂量组6组。缺糖缺氧建模后,利用流式细胞仪,采用免疫荧光标记法检测CFDA-SE标记的大鼠NSCs。通过观察给药后NSCs第1、3、7天各子代荧光强度的变化情况,来研究不同浓度BMECG对NSCs的抗损伤、促增殖能力。2.利用基因芯片技术分析BMECG调控OGD/R损伤后NSCs的基因表达变化。采用全转录组表达谱芯片对模型组与BMECG干预组NSCs给药第7天差异基因变化情况进行研究,并利用差异基因数据进行Pathway等分析,筛选出BMECG发挥促NSCs增殖作用的靶基因和相关信号通路,为进一步研究其促NSCs增殖的分子机制提供实验依据。3.采用双侧颈总动脉夹闭法建立昆明小鼠全脑缺血再灌注模型（BCAO）,研究BMECG对模型小鼠的干预情况。利用HE染色观察脑组织形态学变化和损伤状况;使用平衡转棒仪对模型以及小鼠脑卒中神经病变后药物干预的行为学进行评价;通过免疫组化染色法测定脑缺血损伤区Nestin蛋白表达变化,判断NSCs增殖率;并采用RT-PCR技术测定小鼠大脑皮层Notch1、Musashi1、Numb等关键节点mRNA的改变,研究BMECG对NSCs促增殖Notch通路的表达来探索其促NSCs增殖作用的机制。结果:1.体外实验中,BMECG对NSCs具有明显地抗缺糖缺氧损伤、促增殖作用,并筛选出活性高于阳性药Rg1的有效剂量（p<0.05）。在不同给药时间点进行观察,第3天,BMECG浓度为12.5 μg/L（中剂量组）时,CFSE标记NSCs荧光值最早到达第4代,促增殖效果好;第7天,BMECG浓度为25μg/L时,第7代荧光值达到最多,促增殖效果最为显着。继续增加BMECG浓度对NSCs的促增殖作用没有帮助。2.基因芯片结果显示BMECG给药组NSCs与模型组相比,引起表达差异2倍以上基因共1043个,其中表达上调基因463个,表达下调基因580个。差异基因主要参与细胞增殖分化、转录调控等相关生物进程。部分差异基因存在于Notch、Wnt、MAPK、CAMP等通路中,这些通路均与NSCs增殖调控相关。该实验结果为深入研究B-BMECG促NSCs增殖的分子机制的提供重要的靶点。3.建立全脑缺血模型后,小鼠脑组织发生了明显地缺血改变,导致神经元水肿、核固缩,并导致神经功能损伤。与模型组相比,BMECG各组及阳性药组均能够增加小鼠平衡转棒仪在棒时间,其电以中剂量组对缺血后小鼠的行为学改善情况最为显着;HE病理染色显示BMECG各组的缺血病理状态相对于模型组有明显地改善（p<0.01）;在给药第7天,BMECG各组可以提高缺血脑组织皮层内Nestin阳性细胞的表达,促进大脑皮层NSCs的增殖。4.通过对小鼠大脑皮层组织进行RT-PCR检测,得到如下结果:相对于模型组,BMECG干预组给药第7天时基因Notch1、Musashi1 mRNA表达升高,Numb mRNA表达降低,且具有统计学差异。其中BMECG高中剂量组相对于阳性药组的变化趋势更加显着。结论:综上所述,本实验首次将蒙药白脉散有效成分组应用于NSCs保护及促增殖能力研究,并对其机制进行初步的探索。BMECG在一定浓度下具有显着的体内外抗缺糖缺氧损伤、促NSCs增殖能力。BMECG的抗脑卒中神经病变药效可能通过Notch、Wnt、MAPK等通路起效,其中在Notch通路中Musashi1-Numb-Notch路径可能起到关键性作用。本课题获得了 BMECG研究的关键实验数据,为民族大复方药效物质基础研究提供新的靶点和思路。
刘欢[5]（2011）在《叶酸调控神经干细胞增殖分化和凋亡对脑梗死大鼠的神经保护作用机制研究》文中指出目的1.通过建立大鼠大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）模型和体外缺氧神经干细胞（neural stem cells, NSCs）损伤模型,免疫荧光双标记检测NSCs增殖分化,观察叶酸对缺血缺氧损伤NSCs增殖分化的影响,明确叶酸能否通过促进NSCs增殖分化对脑梗死大鼠产生神经保护作用。2.通过检测Notch信号通路和ERK信号通路相关基因mRNA和蛋白表达,在抑制ERK通路条件下进一步观察NSCs增殖分化,探讨叶酸对缺血缺氧损伤NSCs增殖分化调控机制。3.通过凋亡率及凋亡基因芯片和线粒体凋亡途径相关蛋白表达检测,观察叶酸对缺氧损伤NSCs凋亡的影响,探讨叶酸对NSCs凋亡调控的可能机制,为研究叶酸对缺血缺氧性脑损伤的防治提供科学依据。方法1.SD大鼠随机分为假手术组（Sham-OP）、中动脉栓塞组（MCAO）、中动脉栓塞+叶酸低剂量组（MCAO+LFA）和中动脉栓塞+叶酸高剂量组（MCAO+HFA）。栓线法制备大鼠MCAO模型, Sham-OP组和MCAO组以生理盐水10ml/kg·bw·d灌胃, MCAO+LFA组和MCAO+HFA组以叶酸溶液4mg/kg·bw·d和12mg/kg·bw·d灌胃,干预28d后制备MCAO模型,进行神经功能评分和脑组织含水量检测,氯化四氮唑（TTC）染色检测脑梗死体积百分比,测定血清叶酸和同型半胱氨酸（Hcy）含量变化,TUNEL法检测神经细胞凋亡率,HE染色观察脑组织病理改变,Y迷宫检测各组学习记忆能力,免疫荧光双标记检测脑组织内源性NSCs增殖分化,Western blot测定脑组织β-Tubulin-Ⅲ蛋白表达。原位杂交检测脑组织在梗死后不同时间点Notch1、Hes1/5、Mash1、Ngn1/2基因mRNA表达,Western blot检测梗死侧脑组织Notch1、Hesl/5以及pERK1/2蛋白表达。U0126阻断ERK通路后,再次检测内源性NSCs增殖和pERKl/2蛋白表达。2.体外培养新生SD大鼠NSCs,细胞分为正常对照组（Control）,缺氧损伤组（Hypoxia）,缺氧叶酸低剂量组（Hypoxia+FA-L）,缺氧叶酸高剂量组（Hypoxia+FA-H）和缺氧叶酸缺乏组（Hypoxia+FA-D）。各组叶酸终浓度分别为4μg/ml、44μg/ml和0.65μg/ml,在1%02中缺氧损伤8h。MTT法检测细胞活力,增殖第6d以免疫组化双标记法检测NSCs增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡率,分化第6d以Western blot检测GFAP和β-Tubulin-Ⅲ蛋白。实时定量PCR检测细胞增殖和分化期Notch1、Hesl/5、Mash1、Ngnl/2以及ERK1/2基因mRNA表达,Western blot检测Notch1、Hes1/5和pERK1/2蛋白表达。U0126阻断ERK通路后检测NSCs增殖和pERK1/2蛋白表达。凋亡基因芯片检测Hypoxia和Hypoxia+FA-H组NSCs凋亡相关基因表达差异,Western blot检测各组NSCs的细胞色素C （Cyt C）、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3/9蛋白表达,检测各组培养基Hcy浓度。结果1.叶酸对脑梗死大鼠内源性NSCs和体外缺氧NSCs增殖分化的影响：叶酸补充可升高大鼠血清叶酸浓度,降低其血浆Hcy水平,叶酸干预组大鼠神经功能损伤程度和脑梗死体积小于MCAO组,学习记忆能力高于MCAO组,MCAO+HFA组大鼠脑组织含水量和神经细胞凋亡率低于MCAO（P<0.05）。各组大鼠内源性NSCs增殖能力在脑梗死后7d达到高峰,MCAO+HFA组大鼠脑组织BrdU+Nestin+细胞数量高于其他各组（P<0.05）。各组大鼠脑组织BrdU+GFAP+细胞和BrdU+NeuN+细胞数量在脑梗死后14d达到高峰,MCAO+HFA组高于其他各组（P<0.05）,同时叶酸干预组脑组织β-Tubulin-Ⅲ蛋白表达高于MCAO组（P<0.05）。体外实验中,缺氧损伤后,两叶酸添加组细胞活力高于Hypoxia组,Hypoxia+FA-D组细胞活力低于Hypoxia组（P<0.05）。增殖第6d,两叶酸添加组BrdU+estin+细胞率高于Hypoxia组,且Hypoxia+FA-H组高于Hypoxia+FA-L组;而Hypoxia+FA-D组BrdU+Nestin+细胞率则低于Hypoxia组（P<0.05）。分化第6d,Hypoxia+FA-H组GFAP蛋白表达高于Hypoxia组,(3-tubulin-III蛋白表达低于Hypoxia组,Hypoxia+FA-D组该两种蛋白表达均低于其他各组（P<0.05）。2.叶酸对脑梗死大鼠脑组织和体外缺氧NSCs Notch和ERK信号通路相关基因表达的影响：大鼠脑梗死后7d, MCAO+HFA组Notch1、Hesl/5 mRNA和蛋白表达高于其他各组,两叶酸干预组Mashl mRNA表达低于MCAO组（P<0.05）,MCAO+HFA组Ngnl/2 mRNA表达强度低于其他各组（P<0.05）。体外实验中,无论增殖期还是分化期,Notch1、Hesl/5mRNA和蛋白在Hypoxia+FA-H组表达量最高,在Hypoxia+FA-D组表达量最低（P<0.05）。Mash1、Ngn1/2 mRNA在Hypoxia+FA-H组表达量最低（P<0.05）。大鼠脑梗死后7d,MCAO+LFA组和MCAO+HFA组pERK1/2蛋白表达高于MCAO组（P<0.05）。U0126阻断ERK通路后,可以降低叶酸干预组pERK1/2蛋白的高表达和脑组织BrdU+Nestin+细胞数（P<0.05）。体外实验中,Hypoxia+FA-L组和Hypoxia+FA-H组在增殖期pERK1/2蛋白表达高于Hypoxia组和Hypoxia+FA-D组（P<0.05）。U0126阻断ERK通路可降低叶酸干预组的细胞活力和BrdU+Nestin+细胞率,同时抑制pERK1/2蛋白表达（P<0.05）。3.叶酸对体外缺氧NSCs凋亡的影响和线粒体凋亡途径的作用：增殖第6d,Hypoxia组细胞凋亡率高于Control组、Hypoxia+FA-L组和Hypoxia+FA-H组,而低于Hypoxia+FA-D组（P<0.05）。Hypoxia+FA-H组与Hypoxia组相比,表达上调的基因有bcl2和Hprtl,下调的基因有p53、apaf-1、bax以及caspase-3/9o Western blot检测结果显示Cyt C、Bax、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表达量在两叶酸添加组均低于Hypoxia组,Hypoxia+FA-D组高于Hypoxia组；Bcl-2蛋白在两叶酸添加组均高于Hypoxia组,Hypoxia+FA-D组低于Hypoxia组（P<0.05）。结论叶酸对脑梗死大鼠的神经保护作用与促进其内源性NSCs增殖有关,体外实验证明叶酸对缺氧损伤NSCs的增殖和向星形胶质细胞细胞分化有促进作用,对体外缺氧NSCs向神经元分化有一定抑制作用,叶酸缺乏则抑制缺血缺氧环境中NSCs的增殖分化。Notch信号通路和ERK信号通路在叶酸对NSCs增殖分化影响中起重要作用,而叶酸对体外缺氧NSCs凋亡的抑制作用与线粒体途径有关。
熊雷[6]（2010）在《生理性低氧对神经干细胞中miR-210的表达调控及功能研究》文中研究指明神经干细胞（neural stem cells, NSCs）具有自我更新和分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力,在神经功能损伤修复以及相关中枢神经系统疾病的治疗中具有重大的应用价值。NSCs体外培养技术的发展为干细胞移植提供了稳定而安全的来源。对临床应用来说,NSCs是否具有良好的增殖状态和定向分化能力十分重要。传统NSCs培养系统一般都采用20%O2的大气氧浓度,实际上在发育过程与成年脑组织中,局部氧水平较低,平均约1—5%,一些学者称之为“生理性低氧”。这种局部微环境低氧对NSCs增殖与分化的影响尚没有引起人们的注意。最近的研究发现低氧这一物理因素能够有效促进体外培养NSCs的增殖,并能调节NSCs的分化方向,低氧诱导因子-1 （hypoxia inducible factor-1,HIF-1）可能在这一过程中发挥着重要作用。但是关于低氧调控NSCs发育的具体机制仍有许多未明之处。miRNAs （microRNAs）是内源产生的一类～22 nt大小的非编码RNA,它可以通过翻译抑制或RNA剪切影响多种靶基因的表达,从而调控细胞的生长发育等。研究发现多种miRNAs在神经系统中时序性和组织特异性地表达,表明它们在神经系统的发育中可能具有重大的调控作用。低氧作为胚胎发育和成年脑组织的生理环境,很可能通过调节这些miRNAs的表达而影响神经干细胞的增殖和分化。本研究利用微阵列技术筛选了一批在NSCs中特异表达和表达水平受低氧调控的非编码RNA,并对其中表达水平变化明显的miRNAs进行验证。然后我们选取了低氧下表达变化最显着的miR-210,从HIF-1调控通路和DNA甲基化调控两个方面深入研究低氧诱导miR-210表达的机制,并对miR-210在NSCs中的功能进行了初步探索。一、NSCs的分离培养鉴定以及低氧时NSCs中HIF-1α稳定的机制我们从E13.5的SD大鼠中脑分离培养出生长状态良好的NSCs,将细胞用免疫荧光染色进行Nestin鉴定,结果表明几乎所有的细胞都表现为Nestin阳性。用血清诱导NSCs分化后,我们用神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的标志蛋白Tuj1 （β-tubulinⅢ）. GFAP和CNPase来评估培养细胞的分化潜能,结果表明NSCs能成功地分化出三种细胞型。这些实验表明我们成功地获取了具有自我更新和分化能力的NSCs,可用于后续的实验。前期的研究显示HIF-1在低氧促NSCs增殖中发挥着关键作用,我们又进一步补充了HIF-1a在低氧下稳定的机制。将NSCs分别置于20%02和3%02环境培养1、3、6、12、24、48、72 h, Western Blot检测表明低氧诱导了不同时间点HIF-1a的表达。而用HSP90的特异性抑制剂格尔德霉素（GA）处理NSCs能时间依赖性和剂量依赖性地下调HIF-1a的蛋白表达水平,并显着降低HIF-1的靶基因VEGF和EPO的表达。用CCK-8法检测发现与20%02相比,3%O2能显着提高NSCs的存活率,而GA处理后细胞存活率显着下降。另外,用流式细胞法检测NSCs的增殖指数（PI）和细胞周期发现低氧能显着促进NSCs的增殖,并增加了S期的细胞,GA处理后则能逆转这一效应。研究表明HSP90参与维持了HIF-1a的蛋白稳定,抑制HSP90活性能降低HIF-1α的蛋白水平并影响NSCs的增殖。二、低氧下NSCs中表达变化的miRNAs的芯片筛选及表达验证将生长状态良好的NSCs分别置于常氧（20%02）和低氧（3%02）环境培养三天后,用非编码RNA （ncRNAs）芯片分析低氧对NSCs中ncRNA表达的影响。研究显示15种低氧后表达明显上调的ncRNAs和11种表达下调的ncRNAs。接着用Real-Time PCR的方法选取一批低氧表达上调的miRNAs进行表达验证,结果表明低氧能诱导miR-210、376a、221、497、338、301、148a、34a、146b、181d、350、29b和344等的表达增加,其中miR-210变化最为显着,NSCs在3%02环境培养3天后,miR-210表达水平上调了15倍,在0.3%02环境则上调了80倍之多。对这些miRNAs的调控序列进行生物信息学分析发现其中miR-210、miR-338、miR-497、miR-29b/29c和miR-148b这6种miRNA调控序列含有HIF-1的识别序列HRE元件,提示低氧时它们的表达可能与HIF-1途径相关。三、低氧时NSCs中miR-210表达调控机制的研究为了研究HIF-1是否调控了miR-210等的表达,我们将miR-210、miR-338和miR-497三种miRNA的调控序列构建到pGL3-Basic荧光素酶载体中,同时构建了pEGFP-HIF-1过表达载体。载体共转染HeLa细胞后,用双荧光检测法检测荧光素酶活性,发现低氧能显着上调pGL3-210荧光素酶活性,而过表达HIF-1在常氧时也能显着增加pGL3-210荧光素酶活性。结果表明HIF-1直接参与了miR-210的表达调控,而miR-338和miR-497的表达则不受影响。此外,我们用染色质免疫沉淀法（ChIP）分析,发现从HIF-1蛋白上洗脱的DNA模板中能扩增出miR-210调控序列片段,证明了HIF-1直接结合miR-210基因序列从而调控其表达。我们接着分析了DNA甲基化对miR-210的表达调控。软件分析发现miR-210的基因正处于一个密集的CpG岛内。用DNA甲基化抑制剂5-aza-2’-deoxycytidine（Aza）处理NSCs后,定量PCR检测发现常氧下miR-210表达剂量依赖性地上调,用2μM Aza处理细胞48 h可以使miR-210的表达量增加3.75倍,而作为对照,调控序列上没有CpG岛的miR-338则表达完全不受Aza的影响。用重亚硫酸盐测序法检测了20% O2、3% O2和0.3% O2三种环境下培养3天的NSCs中miR-210调控序列的甲基化水平,结果发现在基因片段上的63个CG位点中有26个位点检测出了甲基化修饰状态的存在。miR-210基因的甲基化水平在3%02和0.3%O2时分别下降了22%和49%。其中第58位CG位点由常氧时的半甲基化状态在低氧后变成接近去甲基化状态。上述结果表明低氧能够通过降低miR-210调控序列的甲基化水平而上调其表达。我们进一步对NSCs中DNA甲基化转移酶（DNA methyltransferase, Dnmts）和组蛋白乙酶转移酶（histone acetyltransferase, HAT）的表达及活性进行了分析。结果显示0.3%02能显着下调Dnmt3b的表达水平。而Dnmts家族的活性在低氧后呈下降趋势,HAT活性则在低氧后呈上升趋势。结果表明低氧有可能通过降低NSCs中Dnmts活性并增强HATs活性,来降低DNA甲基化水平并促进组蛋白乙酰化使染色质空间结构打开,从而有利于转录因子和RNA聚合酶对基因的转录调控。四、miR-210在神经干细胞及组织发育中的功能研究在本部分研究中,我们用miR-210的慢病毒过表达载体转染NSCs, CCK-8检测发现过表达miR-210能显着增强NSCs在缺氧环境中的存活率。另外,我们检测了E13、E17和E21胎鼠脑组织中miR-210的表达,发现随着胎龄增长,miR-210表达量也显着增加。合成特异抑制miR-210功能的寡核苷酸后,用子宫胚胎电穿孔法将其转染到E16大鼠胚胎的侧脑室中,发现miR-210功能被抑制的胎鼠发育停滞并表现出致死效应,而对照组则正常存活。这些结果表明miR-210可能在神经系统的发育中具有重要的调控作用。综上所述,HIF-1在低氧促进体外培养NSCs的增殖中起着重要的作用。低氧上调了一系列miRNAs的表达,其中miR-210表达水平变化最为明显。低氧一方面维持了HIF-1α的稳定,另一方面降低了miR-210调控序列的甲基化水平并影响组蛋白乙酰化,使DNA空间结构打开,加强转录因子和RNA聚合酶的结合从而上调miR-210的表达。miR-210的表达受转录因子HIF-1和DNA甲基化的共同调控。而低氧环境下NSCs中miR-210的高表达对于细胞的存活和组织的正常发育是必需的。
张律文[7]（2010）在《基因调控网络的数值研究》文中研究说明随着计算机科学和生物实验技术的发展,通过研究和应用高效算法、结合高性能计算技术,对海量生物学数据进行整合和分析的计算系统生物学正成为21世纪自然科学的核心领域之一。如何分析、阐明和理解基因表达数据从而构建基因调控网络是目前计算系统生物学研究中面临的重大挑战。本论文将计算机科学应用于基因组学,从计算系统生物学的角度研究基因调控网络。论文围绕基因调控网络的构建问题,从数值研究的角度出发,一方面基于基因表达的实验数据,定性地分析基因调控关系;另一方面通过网络的拓扑特性,分析网络的动力学稳定性,以计算模拟的方法生成人工基因调控网络。论文还进一步应用以上算法及其并行思想,构建小鼠脑部神经干细胞（NSC）的基因调控网络,预测重要的调控信号通路,并获取关键基因的功能信息。本论文的创新性工作主要有四个方面:（一）以单基因扰动的稳态数据为分析对象,本文提出了基于线性微分方程模型的逐步回归网络推断算法（Stepwise Network Inference Method,SWNI）。针对基因调控网络较稀疏的特点,根据严格的选元准则,为目标基因逐步选择最具显着影响的调控子子集,克服了高维小样本的实验数据问题,避免了以往算法中对目标基因强制设定最大连接数的不合理性。实验表明,随着网络规模的增大和网络稀疏度的增加,SWNI算法在计算精度、计算效率上均优于同类算法。（二）基于复杂网络理论和真实基因调控网络的拓扑特性,充分考虑网络的生物学鲁棒性和动力学稳定性,本文提出了人工基因网络的生成过程和模拟方法,并构建基因调控网络模拟器（Gene Network Simulator,GN-Simulator）。实验结果表明,GN-Simulator能模拟在拓扑结构上和动力学性质上与真实基因调控网络高度相似的大规模人工网络,并产生用于无偏验证的多样化人工基因表达数据集,为基因调控网络的构建算法提供高效、合理的计算实验平台。（三）论文从基因组学的角度研究基因dcf1在小鼠神经干细胞分化中的作用机制,应用SWNI算法,将数值实验与生物实验相结合,将公共数据库中的基因芯片数据与实验室数据相整合,构建关于dcf1的小鼠神经干细胞基因调控网络。论文预测了pou6f1显着影响脑部神经干细胞分化的功能,该功能与对dcf1的部分研究结果相符;预测了pou6f1对dcf1的显着调控作用,预测结果与已发表的文献中对含POU结构域的蛋白的研究相吻合;分析了dcf1在预测网络中所处的位置,提示dcf1可能处于其调控通路的下游,为进一步探索dcf1的功能奠定了很好的基础。（四）论文将并行计算思想应用于大规模的基因调控网络构建和模拟问题,提高了网络构建的效率,初步满足了对大规模基因表达数据进行分析和处理的需要;通过并行化策略,论文实现了对小鼠神经干细胞高通量基因芯片数据的整合分析,极大提高了处理计算系统生物学中实际问题的能力。
焦淑洁[8]（2009）在《血管内皮生长因子在人胚胎干细胞神经分化过程中的作用及相关机制研究》文中指出近年来，人胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESCs）向神经细胞诱导分化的成功，为各种难治性神经系统疾病细胞移植治疗提供了理想的载体。从胚胎干细胞诱导分化为特异的神经元或胶质细胞的关键步骤是神经干细胞（neural stem cells，NSCs）的生成。目前采用的hESCs分化为NSCs的诱导方法大致可分为三种：一是经拟胚体（embryonic bodies，EBs）诱导法。通过模仿胚胎内生成神经外胚层的环境来产生神经干细胞，是应用最广泛的诱导方法。但是该法周期长，所需hESCs细胞量大，操作技术含量较高。二是与具有特殊诱导能力的基质细胞共培养法。不过基质细胞所提供因子的具体作用未被阐述，是否对神经细胞有后续作用尚需进一步观察，一定程度上阻碍其应用；三是用特定的诱导因子使胚胎干细胞直接定向分化法。研究发现去除细胞内各种抑制神经分化的信号传导和细胞间相互抑制作用时，未分化的ESCs会自发向神经细胞分化，基于此产生了直接分化法。该法诱导hESCs生成NSCs已有报道，但尚未形成统一有效的诱导方法。对脊椎动物成体内神经发生的研究表明，内皮细胞通过产生血管微环境（vascular niche），促进成体神经干细胞的增殖。在体外，内皮细胞也可以诱导大鼠神经干细胞转化成神经元。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是内皮细胞分泌的主要因子，在这些体内外过程中发挥关键作用。VEGF通过VEGFR2．对海马等脑组织内神经发生区的神经干细胞发挥促生长、存活和趋化的作用。研究发现干细胞本身也可以产生分化调控信号来调节自身的增殖分化。诸多研究初步揭示了Notch信号转导通路在维持神经干细胞多能性、调节神经元和胶质细胞分化中有重要作用。此外，研究表明丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信号转导途径在中枢神经系统广泛表达，各种细胞外刺激信号均可通过这一通路影响突触传递，神经元的重塑和生存等。本研究对经EB法与直接分化法诱导hESCs生成NSCs进行比较，以探索适合临床应用的经济高效的诱导方法。随后将探讨在体外hESCs神经分化中VEGF是否发挥作用，该作用与Notch和p38 MAPK信号转导通路是否相关，以更深入的研究神经发生过程，明确神经细胞分化中的决定因素和其中的各种相互关系。第一部分人胚胎干细胞体外分化为神经干细胞诱导方法的研究目的探讨适合临床应用的经济高效的人胚胎干细胞分化为神经干细胞的方法。方法人胚胎干细胞生长成熟后，将其脱离饲养层，分离消化为单细胞，以1×105的细胞密度置于培养皿（板）中，用直接分化培养基培养，诱导细胞向神经干细胞分化。结果用直接分化培养基培养脱离饲养层的hESCs，约14～16天生成nestin阳性的NSCs。神经干细胞继续分化，可以得到不同数量的神经元和胶质细胞，MAP2、GFAP分别阳性。结论在体外人胚胎干细胞不经EB，可以直接定向分化为神经干细胞。该方法与传统的经EB法相比，周期短、操作过程简单、成本低，可用于神经系统疾病移植治疗研究中hESCs向NSCs分化的大批量诱导。第二部分血管内皮生长因子在体外hESCs诱导分化为神经细胞中的作用研究目的观察血管内皮生长因子在体外hESCs分化为神经细胞过程中是否发挥作用。方法人胚胎干细胞经拟胚体向神经细胞分化，分别给予VEGF（10ng／mL）和VEGF（10ng／mL）+VEGFR2／Fc嵌合体（10ng／mL）添加入神经细胞分化的各个阶段，通过RT-PCR、免疫荧光法检测各阶段细胞标志物，计算并用流式细胞仪检测各组神经干细胞Nestin的阳性率。结果RT-PCR检测到各阶段细胞标记物表达，在人神经干细胞检测到VEGFR2表达；免疫荧光法检测，VEGF作用组产生神经干细胞、分化为神经元的比率明显高于常规经EB诱导组和VEGF+VEGFR2／Fc嵌合体作用组，常规诱导组和VEGF+VEGFR2／Fc嵌合体作用组之间各阶段阳性细胞率无明显差异。结论人神经干细胞表达VEGFR2；在体外人胚胎干细胞向神经细胞的分化过程中，小剂量（10ng／mL）血管内皮生长因子通过血管内皮生长因子受体2，促进神经干细胞增殖及向神经元分化。第三部分人胚胎干细胞定向分化为神经细胞中VEGF作用机制的初步研究目的研究血管内皮生长因子在体外hESCs分化为神经元过程中的作用机制。方法人胚胎干细胞经拟胚体向神经元分化，在VEGF（10ng／mL）作用之前，分别在各阶段细胞中给予γ-分泌酶抑制剂和p38 MAPK抑制剂作用1h，免疫荧光法计算各阶段细胞阳性率，并与常规诱导组和单独VEGF作用组相比较，半定量RT-PCR分析各组细胞Notch信号靶基因Hes1mRNA和p38αmRNA表达。结果hESCs经由EB诱导分化为神经干细胞过程中，γ-分泌酶抑制剂预处理组与常规诱导组神经干细胞的阳性率无明显差异，p38 MAPK抑制剂预处理组的神经干细胞比例与VEGF组无明显差异；RT-PCR检测发现，VEGF作用组Hes1mRNA的表达强于γ-分泌酶抑制剂预处理组和常规诱导组，MTT检测VEGF作用组细胞增殖活性最强。在NSCs进一步分化为神经元中，γ-分泌酶抑制剂预处理组和VEGF作用组的神经元阳性率无明显差异；p38 MAPK抑制剂预处理组与常规诱导组的神经元比例无明显差异，RT-PCR分析显示，VEGF作用组p38αmRNA表达高于p38 MAPK抑制剂预处理组和常规诱导组。结论VEGF通过激活Notch信号转导通路，促进人胚胎干细胞经EB分化为神经干细胞。Notch信号抑制剂可以拮抗这一过程中VEGF的作用，而p38 MAPK与这一过程无明显相关。在人神经干细胞定向分化为神经元中，VEGF经由p38 MAPK途径，促进神经干细胞更多的分化为神经元。p38 MAPK抑制剂可以阻断VEGF的这一作用，Notch信号通路对这一过程不产生影响。
石娟,管英俊,张炳强[9]（2008）在《基因差异表达筛选技术在神经干细胞研究中的应用》文中提出
郭燕春[10]（2007）在《针刺对新生大鼠缺血缺氧性脑损伤皮层神经营养因子及受体基因表达的影响》文中认为背景缺血缺氧性脑病是新生儿期危害最大的常见疾病之一，常导致新生儿死亡以及幸存者后期智力低下、癫痫和脑性瘫痪等严重的神经功能残损，严重危害了新生儿的生命健康和生存质量。西医学迄今为止尚无有效的治疗方法，而中医针刺在治疗缺血缺氧性脑病方面具有独到之处。根据中医理论，本课题组以“补先天之精，调后天之本，充脑髓，壮骨，解痉”为原则，在临床上采用针刺任脉、督脉及膀胱经诸穴位治疗新生儿缺血缺氧性脑病患儿26例，均有不同程度的改善甚或痊愈，取得满意的临床效果，且影像学检查显示治疗后大脑皮层增厚，外部脑积水消失。但针刺治疗缺血缺氧性脑病的机理目前尚未完全明确。本课题组既往研究已证明针刺可促进缺血缺氧损伤大脑皮层神经干细胞增殖，并分化为神经元。另有许多研究显示针刺在治疗神经系统疾病过程中能促使人体产生神经营养因子。因此我们设想：针刺可能通过改善缺血缺氧性脑损伤患儿脑内的微环境（如促进神经营养因子的分泌等）从而激发脑内内源性神经干细胞的增殖、分化潜能，以补充在缺血缺氧性脑损伤中丧失的神经细胞，达到改善缺血缺氧性脑病症状的目的。基因芯片技术是近年来出现并快速发展起来的一项前沿生物技术，具有高效、高信息量的突出优点，可同时检测成千上万个基因，能够对参与疾病过程的众多基因的表达进行快捷、有效的筛查，为针刺治疗缺血缺氧性脑病的基础和临床研究提供了新的技术手段。目的在缺血缺氧性脑病动物模型上模拟临床针刺任脉、督脉及膀胱经治疗新生儿缺血缺氧性脑病的过程，用基因芯片检测针刺治疗后动物模型大脑皮层神经营养因子及受体基因表达的变化，探讨针刺治疗缺血缺氧性脑病的分子机制，为临床针刺治疗新生儿缺血缺氧性脑病提供新的理论依据。方法新生7天龄SD大鼠结扎左侧颈总动脉并缺氧2小时制作新生鼠缺血缺氧性脑病模型。实验动物分为针刺组和对照组。针刺组于建模次日开始行针刺治疗，每天针刺任脉、督脉及膀胱经诸穴位一次，共针刺14天，对照组建模后不作针刺处理。针刺治疗结束后，两组动物均断颈处死，取左侧顶枕叶缺血缺氧病变明显部位的大脑皮层，抽提总RNA，用GEArray Q系列神经营养因子及受体功能分类基因芯片进行检测，筛选差异表达的基因，并进一步用RT-PCR方法进行验证。结果1．针刺组总共有48个基因与对照组有表达差异，占所有被检测基因总数的50％。其中40个（占差异表达基因总数的83.3％）如脑源性神经营养因子（BDNF）、睫状神经营养因子（CNTF）及其受体（CNTFR）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）及其受体（FGFR1）等基因表达上调，8个（占差异表达基因总数的16.7％）如神经调节素1（Nrg1）、神经调节素4（Nrg4）及酪氨酸激酶C（TrkC）等基因表达下调。表达上调的基因涉及神经营养素及受体、神经肽及受体、生长因子及受体、细胞因子及受体、信号传导分子和凋亡相关基因等六大类，表达下调的基因较少，只涉及神经营养素及受体、神经肽及受体、细胞因子及受体、化学因子受体等四大类；2．实时定量PCR结果与芯片杂交结果一致。结论1．针刺对缺血缺氧性脑损伤新生大鼠大脑皮层多种神经营养因子及受体基因的表达有调节作用，其中大部分表达上调，少数下调；2．针刺治疗缺血缺氧性脑病的机制不是简单的上调具有神经保护作用的众神经营养因子的表达，而是通过调节损伤局部微环境中多种神经营养因子及受体的表达，各种神经营养因子及受体之间还通过相互作用、相互调节，其总合作用促进脑内神经干细胞增殖、分化为神经元，同时保护缺血缺氧损伤的神经细胞，最终促进受损脑组织的修复；3．针刺还调节了神经肽及受体基因、细胞因子基因、信号传导分子基因、凋亡相关基因等的表达，提示针刺对缺血缺氧性脑病治疗机制的复杂性，可能是通过多条途径，作用于多个靶点而最终实现的；4．功能分类基因芯片能够对针刺治疗前后新生大鼠缺血缺氧损伤大脑皮层神经营养因子及受体基因的表达情况进行快捷、有效的筛查，结果具有较高的可靠性。
二、神经干细胞分化前后基因表达变化的DNA微阵列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、神经干细胞分化前后基因表达变化的DNA微阵列分析（论文提纲范文）
（1）MiR-140-5P在小儿先天性巨结肠发病机制中的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 应用miRNA基因芯片技术分析先天性巨结肠miRNAs表达谱差异 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 MiR-140-5p在先天性巨结肠中的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究生期间发表论文情况 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
| 英文文章1 |
| 英文文章2 |
（2）两种中医治法对脑缺血再灌注大鼠神经干细胞增殖分化wnt/β-catenin信号转导通路基因及差异蛋白表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 实验一 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 实验二 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 讨论 |
| 1 现代医学对缺血性脑血管病的认识 |
| 2 中医药与缺血性脑卒中 |
| 3 神经干细胞在缺血性脑卒中中的修复作用 |
| 4 基因芯片技术 |
| 5 两种中医治法的选择 |
| 6 Wnt/β-catenin 信号通路在神经干细胞增殖分化过程中的调控作用倍受关注 |
| 7 实验结果讨论 |
| 结语 |
| 1 结论 |
| 2 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）NSCs三维培养及其微流控动态模型的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| CONTENTS |
| 图表目录 |
| 英文缩写表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 国内外研究进展 |
| 1.2.1 哺乳动物NSCs及影响其增殖与分化的主要因素 |
| 1.2.2 三维培养 |
| 1.2.3 微流控芯片技术在生物学研究领域的应用 |
| 1.3 本文的研究思路与主要研究内容 |
| 2 小鼠神经干细胞的分离、培养与生物学特性鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器与材料 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 mNSCs原代培养 |
| 2.3.2 mNSCs继代培养 |
| 2.3.3 免疫荧光鉴定 |
| 2.3.4 生长曲线的测定 |
| 2.3.5 统计学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 细胞接种密度对原代mNSCs生长状态与增殖的影响 |
| 2.4.2 不同细胞接种密度对原代mNSCs“神经球”大小分布的影响 |
| 2.4.3 传代培养的mNSCs生长状态 |
| 2.4.4 mNSCs特异性蛋白表达 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 3 mNSCs无血清扩增培养基的优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验仪器与材料 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 培养基筛选的正交实验 |
| 3.3.2 免疫荧光染色 |
| 3.3.3 生长曲线的测定 |
| 3.3.4 葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺及氨的测定 |
| 3.3.5 参数计算方法 |
| 3.3.6 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 正交试验的优化结果 |
| 3.4.2 不同培养组在不同的培养时间内细胞的生长状态 |
| 3.4.3 优化培养基MA对mNSCs生长的影响 |
| 3.4.4 优化前后培养基中葡萄糖对mNSCs生长代谢的影响 |
| 3.4.5 优化前后培养基中谷氨酰胺对mNSCs生长代谢的影响 |
| 3.4.6 优化前后培养基中乳酸/葡萄糖得率系数和氨/谷氨酰胺得率系数 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 4 mNSCs的体外静态三维培养 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验仪器与材料 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 mNSCs在胶原凝胶中的固定 |
| 4.3.2 mNSCs-胶原三维构建物的培养方法 |
| 4.3.3 生长曲线的测定 |
| 4.3.4 三维构建物内细胞的死活染色 |
| 4.3.5 三维构建物的免疫组织化学染色 |
| 4.3.6 三维构建物的免疫荧光染色 |
| 4.3.7 Real Time PCR检测 |
| 4.3.8 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 培养条件对mNSCs三维构建物内细胞形态的影响 |
| 4.4.2 三维构建物内细胞的生长状况 |
| 4.4.3 三维构建物内细胞的活性 |
| 4.4.4 mNSCs在扩增条件下干/祖细胞特性的鉴定结果 |
| 4.4.5 构建物内细胞的类型与分布 |
| 4.4.6 RNA的提取与质量 |
| 4.4.7 两种不同培养条件下mNSCs及其功能细胞相关基因的mRNA表达水平变化 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 5 基于微流控技术的mNSCs三维模型的构建 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料及设备 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 试剂与药品 |
| 5.2.3 主要仪器设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 微流控芯片的设计 |
| 5.3.2 微流控芯片上mNSCs-胶原三维复合物的构建 |
| 5.3.3 mNSCs二维贴壁模型的建立 |
| 5.3.4 NSCs-胶原三维静态模型的构建与培养 |
| 5.3.5 免疫荧光染色 |
| 5.3.6 微流控芯片内谷氨酰胺与乳酸浓度的测定 |
| 5.3.7 统计学分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 微流控芯片的结构与特征 |
| 5.4.2 建立了适用于mNSCs三维培养的微流控操控系统 |
| 5.4.3 mNSCs-胶原复合物在微流控芯片上的生长状况 |
| 5.4.4 微流控芯片上三维mNSCs及其分化细胞标记蛋白的鉴定 |
| 5.4.5 静态与动态培养体系中谷氨酰胺和乳酸浓度的监控结果 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 实验结论 |
| 6.2 工作展望 |
| 6.3 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录A 附录 主要符号表 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间科研项目及科研成果 |
| 致谢 |
（4）白脉散有效成分组调控神经干细胞增殖的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 第一节 缺血性脑卒中及其后遗症治疗现状 |
| 1.1.1 缺血性脑卒中及其后遗症 |
| 1.1.2 恢复期常用治疗方法 |
| 1.1.3 结语 |
| 第二节 Notch信号通路对神经干细胞影响的研究进展 |
| 1.2.1 Notch通路的组成及功能概述 |
| 1.2.2 Notch信号通路对神经干细胞的影响 |
| 1.2.3 Notch相关基因变化 |
| 1.2.4 结语 |
| 第二章 白脉散有效成分组BMECG体外促进神经干细胞增殖能力的研究 |
| 第一节 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 药品和试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要实验用品 |
| 2.1.5 溶液的配制 |
| 第二节 神经干细胞的分离、培养及鉴定 |
| 2.2.1 体外大鼠神经干细胞培养 |
| 2.2.2 体外培养大鼠神经干细胞鉴定 |
| 2.2.3 单细胞悬液的制备 |
| 2.2.4 大鼠神经干细胞OGD/R损伤模型的建立 |
| 2.2.5 BMECG剂量初步筛选 |
| 2.2.6 BMECG促体外培养大鼠神经干细胞损伤后增殖作用 |
| 2.2.7 BMECG诱导NSCs增殖的基因芯片研究 |
| 第三节 实验结果 |
| 2.3.1 形态学观察鉴定 |
| 2.3.2 NSCs单细胞悬液制备方法选择 |
| 2.3.3 换液与DMSO对实验的影响 |
| 2.3.4 BMECG对损伤后NSCs促增殖作用剂量筛选 |
| 2.3.5 BMECG对体外培养大鼠NSCs促增殖作用 |
| 2.3.6 基因芯片分析 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 |
| 第三章 白脉散有效成分组BMECG在体促进神经干细胞增殖能力的研究 |
| 第一节 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 药物和试剂 |
| 3.1.4 器材 |
| 3.1.5 溶液的配制 |
| 第二节 实验方法 |
| 3.2.1 小鼠全脑缺血模型的建立 |
| 3.2.2 小鼠分组给药 |
| 3.2.3 检测指标及方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 3.3.1 实验小鼠一般情况及死亡率影响 |
| 3.3.2 BMECG对全脑缺血小鼠行为学功能的影响 |
| 3.3.3 BMECG对全脑缺血小鼠脑组织病理形态的影响 |
| 3.3.4 BMECG对全脑缺血小鼠脑组织Nestin表达的影响 |
| 3.3.5 BMECG对全脑缺血小鼠脑组织脑含水量的影响 |
| 3.3.6 总RNA提取结果 |
| 3.3.7 RT-PCR检测BMECG对notch1 mRNA表达的影响 |
| 3.3.8 RT-PCR检测BMECG对musashi1 mRNA表达的影响 |
| 3.3.9 RT-PCR检测BMECG对numb mRNA表达的影响 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术成果目录 |
（5）叶酸调控神经干细胞增殖分化和凋亡对脑梗死大鼠的神经保护作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、叶酸对脑梗死大鼠内源性NSCs增殖分化的作用 |
| 1.1 对象与方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.1.3 统计分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 叶酸对脑梗死大鼠血清叶酸含量的影响 |
| 1.2.2 叶酸对脑梗死大鼠血浆Hcy水平的影响 |
| 1.2.3 叶酸对脑梗死大鼠神经功能的影响 |
| 1.2.4 叶酸对脑梗死大鼠认知能力的影响 |
| 1.2.5 叶酸对脑梗死大鼠脑组织含水量的影响 |
| 1.2.6 叶酸对脑梗死大鼠脑梗死体积的影响 |
| 1.2.7 叶酸对脑梗死大鼠脑组织形态的影响 |
| 1.2.8 叶酸对脑梗死大鼠神经细胞凋亡的影响 |
| 1.2.9 叶酸对脑梗死大鼠内源性NSCs增殖的影响 |
| 1.2.10 叶酸对脑梗死大鼠内源性NSCs分化的影响 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 叶酸对脑梗死大鼠的神经保护作用 |
| 1.3.2 神经干细胞增殖分化的鉴定 |
| 1.3.3 神经干细胞与局灶性脑梗死 |
| 1.3.4 叶酸对脑梗死大鼠内源性NSCs增殖分化的影响 |
| 1.3.5 叶酸对脑梗死大鼠神经细胞凋亡的影响 |
| 1.4 小结 |
| 二、叶酸对脑梗死大鼠内源性NSCs增殖分化作用机制研究 |
| 2.1 对象与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.3 统计分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 叶酸对脑梗死大鼠脑组织Notch信号通路相关基因mRNA表达的影响 |
| 2.2.2 叶酸对脑梗死大鼠脑组织Notch通路相关蛋白表达的影响 |
| 2.2.3 叶酸通过ERK通路对脑梗死大鼠NSCs增殖的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 Notch信号通路在叶酸影响脑梗死大鼠NSCs增殖分化中的作用 |
| 2.3.2 ERK信号通路在叶酸影响脑梗死大鼠NSCs增殖中的作用 |
| 2.4 小结 |
| 三、叶酸对体外缺氧NSCs增殖分化和凋亡的作用 |
| 3.1 对象与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.3 统计分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 NSCs培养鉴定 |
| 3.2.2 叶酸对缺氧损伤NSCs形态的影响 |
| 3.2.3 叶酸对缺氧损伤NSCs增殖的影响 |
| 3.2.4 叶酸对缺氧损伤NSCs分化的影响 |
| 3.2.5 叶酸对缺氧损伤NSCs凋亡的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 缺氧损伤模型的建立 |
| 3.3.2 叶酸对缺氧NSCs增殖分化的影响 |
| 3.3.3 叶酸对缺氧NSCs凋亡的影响 |
| 3.4 小结 |
| 四、叶酸对体外缺氧NSCs增殖分化和凋亡调控机制研究 |
| 4.1 对象与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.3 统计分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 叶酸对缺氧NSCs Notch通路相关基因mRNA表达的影响 |
| 4.2.2 叶酸对缺氧NSCs Notch通路相关蛋白表达的影响 |
| 4.2.3 叶酸通过ERK通路对缺氧NSCs增殖的影响 |
| 4.2.4 叶酸对缺氧NSCs凋亡影响的作用机制 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 Notch信号通路在叶酸对缺氧损伤NSCs增殖分化影响中的作用 |
| 4.3.2 ERK信号通路在叶酸对缺氧损伤NSCs增殖影响中的作用 |
| 4.3.3 线粒体途径在叶酸对缺氧损伤NSCs凋亡影响中的作用 |
| 4.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）生理性低氧对神经干细胞中miR-210的表达调控及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 目录 |
| 第一部分 引言 |
| 一、哺乳动物神经干细胞 |
| (一) 神经干细胞的特性与定义 |
| (二) 神经干细胞的应用价值 |
| (三) 神经干细胞的来源 |
| 二、低氧的生理意义及对神经干细胞发育的影响 |
| (一) 低氧是胚胎发育和成年脑组织的生理环境 |
| (二) 低氧对神经干细胞增殖和分化的影响 |
| 三、HIF-1途径—低氧调控神经干细胞发育的核心信号通路 |
| (一) HIF-1的发现 |
| (二) HIF-1的功能结构 |
| (三) 氧依赖的HIF-1调控 |
| (四) 非氧依赖的HIF-1调控 |
| (五) HIF-1的靶基因与细胞存活 |
| (六) HIF-1在神经干细胞发育中的作用 |
| 四、microRNAs—低氧调控神经干细胞发育的新发现 |
| (一) miRNAs的发现与命名 |
| (二) miRNAs的特点 |
| (三) miRNAs的加工机制与功能 |
| (四) DNA甲基化对miRNAs的表达调控 |
| (五) miRNAs与神经系统 |
| (六) 低氧对miRNAs表达调控的影响 |
| 五、本研究的目的与意义 |
| 第二部分 神经干细胞的分离培养和鉴定以及低氧时NSCs中HIF-1稳定的调控机制 |
| 一、实验材料与试剂 |
| (一) 主要仪器 |
| (二) 实验动物 |
| (三) 抗体 |
| (四) 主要试剂及常用试剂配方 |
| 二、实验方法 |
| (一) 低氧条件与分组 |
| (二) 原代大鼠中脑神经干细胞的分离 |
| (三) 神经干细胞的传代培养 |
| (四) 体外培养神经干细胞自我更新与分化能力的免疫荧光鉴定 |
| (五) 细胞中总RNA的提取及反转录PCR检测mRNA表达水平的变化 |
| (六) 细胞中蛋白的提取及Western blot检测蛋白表达水平的变化 |
| (七) 流式细胞术检测细胞周期与增殖指数(PI) |
| (八) 细胞存活率分析 |
| (九) 数据处理与统计学分析 |
| 三、实验结果 |
| (一) 原代大鼠中脑神经干细胞的分离培养与鉴定结果 |
| (二) 低氧对体外培养NSCs中HIF-1α和HSP90表达的影响 |
| (三) 抑制HSP90活性对低氧诱导的HIF-1α蛋白稳定的影响 |
| (四) 抑制HSP90活性对神经干细胞存活的影响 |
| 1. 用GA抑制HSP90活性对NSCs存活的影响 |
| 2. 用赤根霉素(Radicicol)抑制HSP90活性对HIF-1α稳定和NSCs存活的影响 |
| (五) 抑制HSP90活性对神经干细胞增殖及细胞周期的影响 |
| (六) 抑制HSP90活性后对HIF-1靶基因表达的影响 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第三部分 低氧下神经干细胞中表达变化的microRNAs的芯片筛选及表达验证 |
| 一、实验材料与试剂 |
| (一) 主要仪器 |
| (二) 主要试剂及常用试剂配方 |
| 二、实验方法 |
| (一) RNA提取与ncRNAs表达谱分析 |
| (二) Real-Time PCR检测miRNAs表达 |
| (三) 生物信息学分析 |
| (四) 数据处理与统计学分析 |
| 三、实验结果 |
| (一) 低氧下NSCs中表达变化的ncRNAs的芯片筛选结果 |
| (二) Q-PCR验证低氧下表达上调的miRNAs |
| (三) 生物信息学分析可能受HIF-1调控的miRNAs |
| (四) 不同氧浓度对NSCs中miR-210的表达影响 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第四部分 低氧时神经干细胞中miR-210表达调控机制的研究 |
| 一、实验材料与试剂 |
| (一)主要仪器 |
| (二) 实验动物、菌株与质粒 |
| (三) 抗体 |
| (四) 主要试剂及常用试剂配方 |
| 二、实验方法 |
| (一) pGL3-miRNA荧光素酶报告质粒的构建 |
| (二) pEGFP-HIF-1过表达质粒的构建、鉴定与表达验证 |
| (三) 双荧光素酶检测系统检测低氧及HIF-1对miRNAs的表达调控 |
| (四) 染色质免疫沉淀分析(ChIP) |
| (五) miR-210调控序列CpG岛分布的软件分析 |
| (六) 亚硫酸氢盐修饰测序法检测基因组DNA甲基化状态 |
| (七) Real-Time PCR检测AZA对NSCs中miRNAs表达的影响 |
| (八) Real-Time PCR检测NSCs中Dnmts家族的表达水平 |
| (九) NSCs中Dnmts及HAT酶活性检测 |
| (十) 数据处理与统计学分析 |
| 三、实验结果 |
| (一) HIF-1途径对miR-210表达的调控 |
| 1. pGL3-miRNA荧光素酶质粒和pEGFP-HIF-1质粒的构建及鉴定 |
| 2. 双荧光素酶系统检测过表达HIF-1对pGL3-miRNA荧光素酶活性的影响 |
| 3. ChIP检测与HIF-1蛋白结合的miRNA调控序列 |
| (二) DNA甲基化对miR-210表达的调控 |
| 1. 软件分析miR-210调控序列的CpG岛分布 |
| 2. AZA抑制DNA甲基化对miR-210表达的影响 |
| 3. 亚硫酸盐修饰测序法检测低氧下miR-210调控序列甲基化修饰水平的变化 |
| 4. 低氧对神经干细胞中Dnmts表达水平的影响 |
| 5. 低氧对神经干细胞中Dnmts和HAT活性的影响 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第五部分 miR-210在神经干细胞及组织发育中的功能研究 |
| 一、实验材料与试剂 |
| (一) 主要仪器 |
| (二) 实验动物 |
| (三) 主要试剂及常用试剂配方 |
| 二、实验方法 |
| (一) miR-210慢病毒载体表达效果检测 |
| (二) CCK-8检测细胞的存活率 |
| (三) BrdU掺入及DAB染色检测细胞的增殖率 |
| (四) E16大鼠子宫胚胎电转及免疫组化检测 |
| 三、实验结果 |
| (一) miR-210慢病毒载体的过表达效果检测 |
| (二) CCK-8法检测过表达miR-210对细胞存活率的影响 |
| (三) BrdU掺入法检测过表达miR-210对细胞存活率的影响 |
| (四) 抑制miR-210对胎鼠神经发育的影响 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 总结 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表及待发表论文 |
| 致谢 |
（7）基因调控网络的数值研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 计算系统生物学的发展、研究现状及意义 |
| 1.2 基因调控网络研究概述 |
| 1.2.1 基因及基因的调控机制 |
| 1.2.2 基因表达数据分析 |
| 1.2.3 基因调控网络研究的意义及难点 |
| 1.3 论文的研究内容及创新 |
| 1.4 论文结构 |
| 1.5 本文小结 |
| 第二章 基因调控网络数值研究的理论及方法 |
| 2.1 构建基因调控网络的问题描述 |
| 2.2 构建基因调控网络的线性微分方程模型 |
| 2.2.1 布尔网络模型、贝叶斯模型和关联网络模型 |
| 2.2.2 线性微分方程模型 |
| 2.2.3 模型的比较与分析 |
| 2.3 具有统计学意义的基因调控网络的评估方法 |
| 2.3.1 假设检验的原理 |
| 2.3.2 假设检验的步骤 |
| 2.3.3 假设检验的方法 |
| 2.4 基因调控网络构建精度的评估方法 |
| 2.5 基因调控网络可视化方法 |
| 2.6 本文小结 |
| 第三章 基于扰动数据的基因调控网络推断算法 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 构建基因调控网络的难点 |
| 3.3 基于多元回归的网络识别算法NIR |
| 3.3.1 NIR 算法 |
| 3.3.2 统计显着性检验 |
| 3.4 逐步回归的网络推断算法SWNI |
| 3.4.1 SWNI 算法 |
| 3.4.2 逐步回归算法流程图 |
| 3.4.3 统计显着性检验 |
| 3.5 算法性能分析 |
| 3.5.1 生物实验数据分析 |
| 3.5.2 数值实验分析 |
| 3.5.3 算法计算速度测试 |
| 3.6 SWNI 算法的并行化应用 |
| 3.6.1 SWNI 算法的并行处理策略 |
| 3.6.2 并行化应用 |
| 3.7 本文小结 |
| 第四章 大规模基因调控网络模拟算法及应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 基因调控网络的复杂网络模型 |
| 4.3 大规模基因调控网络的计算模拟 |
| 4.3.1 基因调控网络的整体拓扑结构模拟 |
| 4.3.2 人工基因调控网络的稳定性和鲁棒性 |
| 4.3.3 从人工网络中产生基因表达数据 |
| 4.4 大规模人工基因调控网络的性能评估 |
| 4.4.1 动力学稳定性测试 |
| 4.4.2 与真实基因调控网络的比较及分析 |
| 4.5 并行模拟大规模基因调控网络的应用 |
| 4.5.1 数据集 |
| 4.5.2 GN-Simulator 的算法评估步骤 |
| 4.5.3 基于大规模人工网络的算法性能分析 |
| 4.6 本文小结 |
| 第五章 小鼠神经干细胞的基因调控网络构建 |
| 5.1 dcf1 与小鼠神经干细胞分化研究 |
| 5.2 数值实验方法 |
| 5.3 实验数据来源 |
| 5.3.1 生物实验数据 |
| 5.3.2 数据库数据 |
| 5.4 结果及分析 |
| 5.4.1 网络的统计学意义 |
| 5.4.2 网络的生物学意义 |
| 5.5 本文小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 未来研究的展望 |
| 参考文献 |
| 作者在攻读博士学位期间完成的学术论文和取得的科技成果 |
| 作者在攻读博士学位期间参与的科研项目 |
| 致谢 |
（8）血管内皮生长因子在人胚胎干细胞神经分化过程中的作用及相关机制研究（论文提纲范文）
| 一、中文摘要 |
| 二、英文摘要 |
| 三、正文 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 人胚胎干细胞体外分化为神经干细胞诱导方法的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 VEGF在体外hESCs分化为神经细胞中作用的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 hESCs定向分化为神经细胞中VEGF作用机制的初步研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 四、主要缩略语 |
| 五、综述一 |
| 参考文献 |
| 六、综述二 |
| 参考文献 |
| 七、附录:博士研究生期间发表论文情况 |
| 八、致谢 |
（10）针刺对新生大鼠缺血缺氧性脑损伤皮层神经营养因子及受体基因表达的影响（论文提纲范文）
| 目录 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语表 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 材料和方法 |
| 1 实验动物 |
| 2 分组 |
| 3 主要试剂及试剂盒 |
| 4 试剂组成、配制 |
| 5 主要仪器、设备 |
| 6 实时定量PCR使用引物列表 |
| 7 动物模型制作过程 |
| 8 针刺取穴及治疗方法 |
| 9 动物取材 |
| 10 神经营养因子及受体基因表达谱分析 |
| 10.1 RNA抽提 |
| 10.2 RNA质量检测 |
| 10.3 探针合成(AMPOLABELING-LPR标记法) |
| 10.4 芯片杂交 |
| 10.5 化学发光检测 |
| 10.6 图像采集和数据分析 |
| 11 实时定量PCR验证芯片数据的可靠性 |
| 11.1 总RNA抽提及质量检测 |
| 11.2 cDNA合成 |
| 11.3 实时定量PCR |
| 第3章 实验结果 |
| 1 动物造模过程及造模后表现 |
| 2 动物模型脑组织形态学改变 |
| 3 神经营养因子及受体基因表达谱分析 |
| 4 实时定量PCR验证芯片杂交的结果 |
| 第4章 讨论 |
| 1 关于基因芯片 |
| 2 针刺对神经营养因子及受体基因表达的影响 |
| 3 针刺治疗HIE的机制 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 附录 1 |
| 附录 2 |
| 致谢 |
四、神经干细胞分化前后基因表达变化的DNA微阵列分析（论文参考文献）
- [1]MiR-140-5P在小儿先天性巨结肠发病机制中的研究[D]. 杜国强. 山东大学, 2020(09)
- [2]两种中医治法对脑缺血再灌注大鼠神经干细胞增殖分化wnt/β-catenin信号转导通路基因及差异蛋白表达的影响[D]. 李霁敏. 安徽中医药大学, 2014(12)
- [3]NSCs三维培养及其微流控动态模型的构建[D]. 葛丹. 大连理工大学, 2013(08)
- [4]白脉散有效成分组调控神经干细胞增殖的分子机制研究[D]. 陈小玉. 中央民族大学, 2013(01)
- [5]叶酸调控神经干细胞增殖分化和凋亡对脑梗死大鼠的神经保护作用机制研究[D]. 刘欢. 天津医科大学, 2011(12)
- [6]生理性低氧对神经干细胞中miR-210的表达调控及功能研究[D]. 熊雷. 武汉大学, 2010(05)
- [7]基因调控网络的数值研究[D]. 张律文. 上海大学, 2010(01)
- [8]血管内皮生长因子在人胚胎干细胞神经分化过程中的作用及相关机制研究[D]. 焦淑洁. 华中科技大学, 2009(11)
- [9]基因差异表达筛选技术在神经干细胞研究中的应用[J]. 石娟,管英俊,张炳强. 神经解剖学杂志, 2008(05)
- [10]针刺对新生大鼠缺血缺氧性脑损伤皮层神经营养因子及受体基因表达的影响[D]. 郭燕春. 汕头大学, 2007(02)