一、埃及伊蚊抗凝血因子Xa基因片段的克隆测序（论文文献综述）
张展滔[1]（2019）在《PxSerpin-7调控小菜蛾免疫与发育的分子机制》文中认为Serpin是一类丝氨酸蛋白酶活性调节剂,参与昆虫体内许多重要的生命进程,如先天免疫反应中Toll信号级联反应和黑化反应、消化作用、变态发育等。本实验室前期研究发现重大蔬菜害虫小菜蛾免疫反应与其生长发育阶段具有相关性,昆虫抵御外界病原物的能力会随发育阶段的不同而变化,且在变态发育阶段尤为明显。依据小菜蛾基因组,在测定和比较小菜蛾不同发育阶段转录组数据和蛋白质组数据的基础上,利用生物信息学对转录组与蛋白质组学进行关联分析,发现一个在转录组与蛋白质组中高表达的Serpin（命名为Px Serpin-7）,且与micro RNA存在相互调控关系,推测Px Serpin-7参与调控小菜蛾的生长发育与免疫防御,,但Px Serpin-7是介导了小菜蛾的生长发育调控了免疫防御?还是Px Serpin-7调控了小菜蛾的免疫反应介导了生长发育?为阐明Px Serpin-7调控小菜蛾生长发育与免疫反应的分子机制,本论文利用分子生物学和生化实验,研究其在免疫与发育中的作用,研究结果如下:对在小菜蛾转录组和蛋白质组中表达模式相同的Px Serpin-7的氨基酸序列、结构等进行生物信息学分析,结果表明Px Serpin-7与Bm Serpin-7高度同源,且具有与Ms Serpin-7相似的结构域,表明Px Serpin-7属于Serpin家族,推测具有Ms Serpin-7相似的功能。利用RT-q PCR技术对小菜蛾Px Serpin-7的时空表达模式和微生物的诱导表达研究。结果表明:（1）Px Serpin-7在幼虫血细胞中高表达,且显着的组织特异性及发育阶段特异性。（2）3龄幼虫Px Serpin-7的表达量显着低于其他龄期幼虫,其他龄期幼虫Px Serpin-7表达量差异不显着,且Px Serpin-7的表达量会随着幼虫的发育而波动,表明Px Serpin-7转录表达模式具有龄期发育相关性。（3）微生物诱导实验表明细菌和真菌病原物侵染小菜蛾均能诱导Px Serpin-7的高表达,表明Px Serpin-7是诱导型表达且参与小菜蛾的免疫反应。构建了原核表达质粒,成功表达纯化重组蛋白rcp-Px Serpin-7以及成功制备多克隆抗体anti-Px Serpin-7,ELISA实验检测表明,anti-Px Serpin-7效价滴定为1:512,000。Western blot检测表明,anti-Px Serpin-7能有效识别小菜蛾血浆中的Px Serpin-7蛋白。为了检测Px Serpin-7是否参与酚氧化酶级联反应和黑化反应。实验将重组蛋白Px Serpin-7和多克隆抗体anti-Px Serpin-7分别与血浆进行孵育,测定血浆PO活力。结果表明:（1）绿僵菌侵染小菜蛾幼虫可诱导小菜蛾血浆中的PO活力增强;小菜蛾血浆中PO的活力在细胞壁成分PGN-SA和绿僵菌孢子的诱导下被激活;Px Serpin-7重组蛋白对血浆中的PO活力影响不显着,但抗体anti-Px Serpin-7能显着抑制血浆中PO活力。（2）Px Serpin-7重组蛋白可显着诱导血浆中黑色物质的生成,而抗体antiPx Serpin-7则显着抑制血浆中黑色物质的生成。结果表明Px Serpin-7参与了调控小菜蛾血浆中的黑化反应。为了构建Px Serpin-7蛋白的互作网络,并筛选与Px Serpin-7互作的蛋白。本实验表达了带有His-tag标签的重组Px Serpin-7,利用PULL-DOWN技术筛选了与Px Serpin-7蛋白直接或间接作用的蛋白及可能存在的复合体形式。质谱测序和生物信息学分析筛选得到Serpin1b、SP6、PAP1、PAP3、PAP3a、PPO1、PPO2、P450、PGRP-S2、Gloverin1、Lysozyme2等蛋白,表明这些蛋白与Px Serpin-7直接或间接作用,参与了小菜蛾的免疫反应。利用RNAi技术研究Px Serpin-7在小菜蛾体内的功能。通过显微注射法将ds RNA注射到小菜蛾幼虫体内,RT-q PCR和Western blot检验RNAi的沉默效果。结果表明注射ds RNA 24 h后,Px Serpin-7的m RNA表达量下降率可达98%,蛋白的表达量下降率可达60%。且注射ds RNA后,大部分小菜蛾不能正常化蛹,能化蛹者也不能成功羽化,表明Px Serpin-7参与了小菜蛾的变态发育。本论文初步阐明了Px Serpin-7参与了小菜蛾的免疫与发育。Px Serpin-7在抗菌肽的表达和黑化反应中起重要作用,初步构建了Px Serpin-7蛋白的互作网络,为进一步解析免疫与发育的相关网络提供了基础,也为利用昆虫免疫系统及生长发育系统进行生物防治提供了理论依据。
高云航,李秋菊,娄玉杰,马红霞[2]（2015）在《白纹伊蚊丝氨酸抗凝血AL-71基因的克隆序列分析及原核表达》文中认为丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serpin）对生物的生长发育、生理功能和病理起到重要调节作用。本试验成功克隆白纹伊蚊丝氨酸抗凝血AL-71基因,序列大小为1 383 bp。经同源性分析,该基因与原序列同源性为88.85%,氨基酸同源性为90.24%。同时,对其分子生物学特性进行预测和建模分析,发现白纹伊蚊的氨基酸序列活性部位和催化结构域表现出较高的相似性。成功构建原核表达载体PET-AL-71,经IPTG诱导,获得分子量大小约为50 KDa的AL-71蛋白,与预期结果一致。为下一步在真核表达系统表达奠定基础。
张玉婷[3]（2015）在《镰形扇头蜱P0基因的克隆及其双链RNA（dsRNA）杀蜱效果的研究》文中研究表明蜱,作为专性体表寄生虫,主要侵袭哺乳类、鸟类、爬行类以及两栖类等,其危害不仅在于摄食人和宿主动物的血液,还可通过吸血传播病毒、细菌和原虫等病原,引起人和动物的发病。目前主要通过化学防治来进行蜱的防控,但该方法会污染环境、危害食品安全等。新型防控方法,如疫苗和生物防治,都还未取得成功,因此急需研发其他新型防控蜱的技术。近年来,RNAi已经应用于蜱、蚊子等各种动物的基因功能研究中。因此,本研究在RNAi的原理基础上,选择P0作为靶基因,对双链RNA作为潜在的杀蜱剂进行探索。本研究通过3’RACE和5’RACE的方法从镰形扇头蜱中克隆了P0全长基因。将该基因的ORF克隆至p GEX-4T-1,构建P0/pGEX-4T-1重组质粒,使P0基因在原核表达系统中表达。P0重组蛋白免疫小鼠后,制备抗血清,进行Western blot分析。结果显示,P0基因全长序列为1118 bp,具有一个编码319个氨基酸的开放阅读框,推测P0的蛋白大小约为35 ku,没有信号肽序列。P0与其他蜱种具有很高的同源性,本研究获得的P0基因与微小扇头蜱、长角血蜱的该基因相似性分别为94%、87%。原核表达系统获得的重组蛋白大小为60 ku,Western blot分析显示重组蛋白制备的小鼠血清可以识别镰形扇头蜱体内的唾液腺蛋白。体外合成P0双链RNA和Luciferase双链RNA。将三种转染试剂Lipofectamine 2000、CellfectinⅡ和DMRIE-C与双链RNA混合后浸染镰形扇头蜱的各个发育阶段优化最佳转染试剂、转染试剂与双链RNA的最佳混合比例以及最佳浸染时间。将优化的最佳条件浸染各个发育阶段的蜱之后,观察生物学特性。结果显示:对成蜱、若蜱和幼蜱,最佳转染试剂均为DMRIE-C;针对成蜱和幼蜱,转染试剂与双链RNA的最佳混合比例是1:1,而若蜱,两者的最佳混合比例是1:2;成蜱、若蜱的最佳浸染时间分别为12 h、6 h,而幼蜱的最佳浸染时间则是24 h。杀蜱试验表明蜱体内的P0基因被沉默后,会影响蜱吸血的相关生物学特性,比如:降低24 h吸附率、降低平均饱血体重、延长平均饱血时间等,甚至导致蜱死亡。本研究证实了镰形扇头蜱P0基因沉默情况下对蜱生活史的完成造成严重影响,甚至阻碍其发育繁殖并导致死亡,成为一种可能的抗蜱疫苗候选分子,可为蜱和蜱传病的防治提供科学依据。
李秋菊[4]（2013）在《白纹伊蚊丝氨酸抗凝血AL-174、AL-71基因的克隆及AL-71基因的原核表达》文中认为当今,心脑血管性脑血栓疾病对人类健康和生命的威胁日益严重,探寻和研发治疗抗血栓的药物已经成为各国医疗界的研究热点。近几年来,虽然抑制血小板活性和溶解血栓的药物有所发展,但是这些药物存在一定的不足如副作用多、疗效不显着、周期长等。因此研发出更适合临床应用的抗凝溶栓药物,仍需不断探索和研究。蚊子是多种疾病的传播媒介如登革热、乙型脑炎、黄热病、丝虫病和疟疾等,主要分布于东南亚地区及我国南方大部。当蚊子吸血时唾液便分泌抗凝血物质,这些抗凝血物质不仅可以干扰宿主的免疫反应、凝血反应和炎症反应以便帮助吸血的顺利完成,同时也是一组潜在药理活性的物质。在哺乳动物中,抗凝血酶主要是由肝细胞分泌,是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族重要成员之一,其对维持凝血和抗凝血之间的动态平衡具有重要意义。随着分子生物学与基因工程技术的迅猛发展,若能实现在蚊虫体内提取安全、有效的蛋白酶抑制剂并用于预防、诊断和治疗血栓性疾病,必将为人类抗凝溶栓药物的研发提供重要的参考依据。为探索蚊虫体内抗凝血物质对血栓性疾病的治疗的可行性,本研究成功克隆出白纹伊蚊丝氨酸抗凝血AL-174基因和AL-71基因,并进行AL-71基因的原核表达,为蚊虫抗凝血物质的进一步研究奠定了基础。具体研究结果如下：本试验成功克隆白纹伊蚊丝氨酸抗凝血AL-174基因,经测序分析发现,序列大小为1383bp。经同源性分析,获得的AL-174基因片段与GenBank中已发表的AL-174核苷酸序列同源性可达84.26%,氨基酸序列同源性达82.57%,说明AL-174基因序列在蚊种间具有一定的保守性。从系统发生树上的位置关系可知：白纹伊蚊丝氨酸抗凝血AL-174核苷酸序列位于系统发生树主干支上,说明该基因与其它蚊种亲缘关系较远。利用生物学分析软件对AL-174蛋白一级、二级结构进行预测和三级结构同源建模。结果显示,AL-174蛋白结构中包含大量二硫键,α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲,分子内6个半胱氨酸以1-6、2-4、3-5的连接方式形成三对二硫键,活性部位均含有保守的组氨酸、丝氨酸和精氨酸,催化结构域的多序列比对表现出较高的相似性,并且催化位点的氨基酸残基与丝氨酸蛋白酶抑制剂原基因序列基本一致。本试验成功克隆白纹伊蚊丝氨酸抗凝血AL-71基因,经测序分析发现,序列大小为1362bp。经同源性分析,获得的AL-71基因片段与已发表AL-71基因序列同源性达88.85%,氨基酸序列同源性达90.24%,说明该基因序列在蚊种间具有一定的保守性。系统进化分析表明,白纹伊蚊丝氨酸抗凝AL-71基因序列、原白纹伊蚊丝氨酸抗凝AL-71基因序列和白纹伊蚊丝氨酸抗凝血AL-174基因序列位于系统发生树同一分支上,说明亲缘关系较近。利用生物学分析软件对AL-71蛋白一级、二级结构进行预测和三级结构同源建模,结果显示,AL-71蛋白结构中同样包含大量的二硫键,α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲,催化结构域的多序列比对表现出较高的相似性,并且催化位点的氨基酸残基与丝氨酸蛋白酶抑制剂原基因序列基本一致。本试验成功构建原核表达载体PET-AL-71,并转化到表达稀有碱基Rosetta （DE3）表达菌株中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析,获得了分子量大小约为50KD的AL-71蛋白,IPTG终浓度为37℃诱导5h时蛋白的表达量较高。
禹海鑫[5]（2013）在《褐飞虱致害性变异相关机理研究》文中研究指明褐飞虱Nilapararvata lugens （Stal）属半翅目Hemiptera,飞虱科Delphacidae,是我国及亚洲其它稻区的主要害虫。种植抗性品种一直是防治褐飞虱的一种重要措施。然而,褐飞虱致害性的快速与高度变异往往造成抗虫品种使用年限缩短。而褐飞虱的致害性变异规律目前并不清楚。有研究表明,共生菌、唾液蛋白以及昆虫解毒酶类等在植食性昆虫致害性变异中发挥着重要作用。为此,本文以褐飞虱Mudgo和TN1两种致害性种群为研究对象,以具有解毒功能和存在共生菌的脂肪体及唾液分泌蛋白为研究切入点,通过比较两个种群脂肪体转录组的差异,寻找与褐飞虱致害性相关的可能基因与共生菌；通过剖析唾液分泌蛋白Nl4777在调控水稻防御反应中的作用,揭示褐飞虱致害性变异的机制。主要结果如下：1)对褐飞虱Mudgo及TN1致害性种群的脂肪体转录组进行了高通量测序。结果显示：Mudgo种群获得了32332条unigene, TN1种群获得了33775条unigene,两转录组合并后共获得42621条all-unigenes。对all-unigenes进行NR数据库功能注释发现,匹配到的物种最多的是赤拟谷盗Tribolium castaneum。GO分类结果发现Mudgo和TN1种群分别有15461和14993条Unigene归属于描述分子功能（molecular function）、细胞组分（cellular component）、生物学过程（biological process）这三种本体,两转录组显示出相似的GO分布模式。另外,有21142条all-unigenes得到了COG注释。14656条all-unigenes得到KEGG注释,这些all-unigenes归属于241个不同的通路。在转录组中发现了2884条微卫星SSRs,其中（CAG）n是数量最多的重复单元。两种群脂肪体转录组间共有7860个差异表达基因,它们主要与生化代谢、信号转导、免疫反应及运输等功能相关；其中,得到功能注释的基因为3858个,未得到功能注释的基因为4002个。在得到功能注释的差异表达基因中与初级代谢有关的共找到236个,涉及氨基酸代谢、脂类代谢、糖类代谢、能量代谢和异质代谢（解毒代谢）；与免疫反应有关的基因共57个,40个在Mudgo种群中表达量明显上调,主要涉及病原菌识别基因、免疫信号途径基因、AMPs基因和其它免疫相关基因；与类酵母共生菌（YLS）相关的基因317个,分属于12个属,其中德巴利氏酵母属、克鲁维酵母菌属、路德酵母属、酵母属、裂殖酵母属、Scheffersomyces、范氏酵母属和接合酵母属的YLS在褐飞虱中属首次报道；与Wolbachia相关的基因共找到了22个,20个在Mudgo种群中表达量上调。上述结果为今后研究褐飞虱不同致害性种群分化原因奠定了基础。2)根据本实验室对褐飞虱两致害性种群唾液腺转录组的比较结果,选择了在两个种群中差异表达的分泌蛋白基因Nl4777为研究对象。序列分析表明,基因Nl4777编码242个氨基酸,具有分泌信号肽,具跨膜结构,C端具有2个EF-hand结构域,含8个Ca2+结合蛋白位点,具有很强的Ca2+结合能力。系统进化研究发现该蛋白与其它生物的多重凝结因子缺陷蛋白nultiple coagulation factor deficiency protein同源。荧光定量PCR检测褐飞虱3种内参基因稳定性时发现,在不同组织中内参基因的稳定性排序为：Flightin>18S rRNA> β-Actin;不同发育时期排序为：18S rRNA>β-Actin> Flightin。据此结果对N14777mRNA在褐飞虱不同组织及不同发育期的分布模式进行检测时发现,该基因在两种群唾液腺组织中表达量均最高,在所有发育时间内表达量持续稳定。Nl4777基因在Mudgo种群唾液腺中的表达量比TN1种群唾液腺中的表达量高18.51倍,达到了极显着差异。注射Nl4777的dsRNA可有效沉默Nl4777基因,并发现基因沉默后可显着降低褐飞虱的存活率与蜜露分泌量,但对产卵量没有影响。Western blot分析表明,分泌蛋白Nl4777在褐飞虱取食过程中可以进入水稻。通过分析水稻防御相关信号分子发现,与对照的褐飞虱取食相比,沉默靶标基因的褐飞虱突变体取食导致水稻茉莉酸（JA）含量在为害后的8h显着下降,水杨酸（SA）和过氧化氢（H202）含量分别在24h和8h显着升高。褐飞虱突变体取食也导致水稻的挥发物总量和两种单一挥发物,2-庚醇（2-heptanol）和芳樟醇（linalool）,显着上升,并增强对褐飞虱天敌稻虱缨小蜂（Anagrus milaparvatae Pang et Wang）的引诱能力。上述结果表明,唾液分泌蛋白Nl4777通过抑制水稻的直接与间接防御反应,在褐飞虱致害性变异中发挥了重要作用。
李游山[6]（2013）在《家蚕蛋白酶抑制剂抵御昆虫致病性真菌入侵的分子机理研究》文中指出家蚕是一种具有很高经济价值的绢丝昆虫,有大量的基础研究积累,已经逐渐发展成鳞翅目的模式生物。然而,家蚕易受到环境中各种病原微生物和寄生虫等威胁,发生疾病。昆虫致病性真菌,如绿僵菌、球孢白僵菌、黄曲霉菌和米曲霉菌,都可能引发高致病性蚕病,严重影响茧丝产量和质量,给整个桑蚕行业造成重大经济损失。昆虫致病性真菌,作为一种新型生物农药,已被广泛应用于农林害虫防治和蚊虫控制。真菌生物农药的使用,不可避免的会与家蚕发生交叉感染,可能导致蚕病爆发。因此,阐明昆虫致病性真菌与家蚕相互作用的分子机制,发现新的抗真菌分子,不仅有利于提高家蚕抗真菌能力,而且对农林害虫防治及人类真菌疾病治疗也具有重要意义。昆虫致病性真菌,通过利用丰富的水解酶来穿透昆虫体壁。这些水解酶包括体壁降解蛋白酶和几丁质酶,它们都是重要的毒力因子。过表达这些毒性蛋白酶,可以显着增强致病性真菌的毒力。虽然真菌穿透昆虫体壁的基本模式已经提出,但昆虫是怎样抵御真菌入侵以及与真菌之间具体的相互作用如何都不甚明了,有待于进一步研究。昆虫体壁和血液中含有丰富的蛋白酶抑制剂,这些抑制剂与抵御病原微生物入侵密切相关。为了阐明昆虫抵御真菌入侵的分子机制以及为提高家蚕抗真菌能力寻找新的分子靶标,我们重点对丝氨酸蛋白酶抑制剂进行深入研究。本研究室利用基因芯片技术对家蚕在微生物诱导下的基因表达变化进行调查,发现了19个家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂在微生物经口感染家蚕后,上调或者下调表达,初步表明这些丝氨酸蛋白酶抑制剂可能参与防御病原微生物入侵的过程。特别是TIL（trypsin inhibitor-like cysteine rich domain）家族的蛋白酶抑制剂在球孢白僵菌感染后明显上调表达。因此,可以从家蚕蛋白酶抑制剂中寻找能够有效对抗致病性真菌入侵的蛋白分子,以提高家蚕抗真菌能力。基于此,本论文对TIL家族的BmSPI38和BmSPI39进行了全长克隆、原核表达和活性测定,并对其抵御真菌入侵的分子机理进行了深入的研究；利用3D结构预测和定点突变技术,对BmSPI38和BmSPI39的抑制活性的关键位点进行了分析；并对BmSPI38和BmSPI39在家蚕中的生理存在形式及BmSPI39在茧丝保护中的功能进行了系统的研究。本论文获得的主要研究结果如下：1.丝氨酸蛋白酶抑制剂的全长克隆、原核表达及活性测定基于BmSPI38和BmSPI39（?）勺EST序列,我们对这两个基因分别设计了4个基因特异引物,用于该基因的5’RACE扩增和3’RACE扩增,获得了这两个基因的全长cDNA序列。BmSPI38和BmSPI39都具有一个含有八个半胱氨酸残基的TIL结构域。多序列比对结果表明,与其它物种的丝氨酸蛋白酶抑制剂相比,BmSPI38和BmSPI39的TIL结构域中有2个Cys发生了替换’（Cys2th和Cys6th）,且活性位点也发生了明显变化。基于独特的活性位点和保守的Cys数目,我们认为BmSPI38和BmSPI39是TIL家族丝氨酸蛋白酶抑制剂的新成员。系统发生树分析显示,所有TIL类蛋白酶抑制剂聚为3支,家蚕BmSPI35、 BmSPI36、BmSPI37、BmSPI38、BmSPI39、BmSPI40和BmFPI-F（家蚕真菌蛋白酶抑制剂-F）聚为一支（Group Ⅲ）,铃蟾BbBSTI独自聚为一支（Group Ⅱ）,其余丝氨酸蛋白酶抑制剂聚为一支（Group Ⅰ）。家蚕BmSPI38、BmSPI39与其它物种的TIL家族的蛋白酶抑制剂进化关系较远,而与BmFPI-F的序列相似性较高,推测它们与BmFPI-F具有相似的功能,参与家蚕的免疫过程。利用原核表达技术,我们获得了具有生物活性的BmSPI38和BmSPI39重组蛋白。通过对不同温度或pH条件下的抑制剂活性进行测定,我们发现BmSPI38和BmSPI39具有很高的热和酸碱稳定性。为了确定BmSPI38和BmSPI39所抑制的蛋白酶的类型,我们选择了几种蛋白酶来进行酶活测定实验,结果表明BmSPI38和BmSPI39能够强烈地抑制微生物蛋白酶,如枯草杆菌蛋白酶A和蛋白酶K,但对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶都没有抑制活性。2.BmSPI38和BmSPI393（?）寸真菌体壁降解蛋白酶的抑制及其动力学特征分析为了探讨BmSPI38和BmSPI39是否参与抵御昆虫致病性真菌,我们选取了球孢白僵菌Prl蛋白酶（CDEP-1）来进行酶活抑制和体外结合实验。结果表明,BmSPI38和BmSPI39能够强烈地抑制球孢白僵菌的毒力蛋白酶CDEP-1。RT-PCR分析表明,BmSPI38在头、体壁和脂肪体等免疫相关组织中高量表达,暗示其可能通过抑制真菌分泌的体壁降解蛋白酶,进而阻止真菌穿透表皮侵染家蚕；BmSPI39在家蚕前部和中部丝腺中特异表达,可能参与丝腺相关的某种过程。与绿僵菌的Prl蛋白酶相似,CDEP-1能够诱导家蚕的黑化反应。而BmSPI38和BmSPI39能阻断CDEP-1诱导的黑化反应。这表明,家蚕蛋白酶抑制剂BmSPI38和BmSPI39（?）能够抑制CDEP-1蛋白酶诱导的杀虫性黑化,进而保护家蚕。酚氧化酶前体体外激活实验表明,CDEP-1不能直接激活PPO,可能是通过激活PPO上游的某种蛋白因子,间接激活PPO。本研究阐明了家蚕应对真菌伤害的另一种途径,即阻断昆虫致病性真菌分泌的蛋白酶引发的有害黑化。球孢白僵菌感染后108h,家蚕血液发生了一定程度的黑化,且黑化程度与分生孢子浓度在一定程度上具有正相关性,表明酚氧化酶级联的黑化反应,参与对真菌入侵的免疫应答。本研究中使用的枯草杆菌蛋白酶A、蛋白酶K和体壁降解蛋白酶CDEP-1都属于PeptidasesS8家族,具有一个PeptidasesS8结构域。序列分析表明,PeptidasesS8家族相似性很高,已报道的体壁降解蛋白酶主要是PCSK9ProteinaseKlike亚家族与Subtilisinsubset亚家族中成员,是真菌重要的毒力因子。鉴于枯草杆菌蛋白酶类的相似性很高,且BmSPI38和BmSPI39能够强烈地抑制这些微生物蛋白酶活性,我们认为蛋白酶抑制剂BmSPI38和BmSPI39有助于提高家蚕的抗真菌能力。3.蛋白酶抑制剂抑制球孢白僵菌的入侵为了研究BmSPI39等蛋白酶抑制剂是否参与家蚕对真菌的免疫应答,我们利用不同浓度的球孢白僵菌感染家蚕,并对攻毒后不同时间点的体壁中的BmSPI39进行Western blot分析。结果表明,家蚕蛋白酶抑制剂BmSPI39以四聚体形式在体壁中表达,在球孢白僵菌感染后,先上调表达,后下调表达,参与家蚕对真菌的免疫应答。免疫荧光实验表明,BmSPI39主要定位于内表皮和中表皮中。鉴于该抑制剂能够抑制真菌的体壁降解蛋白酶活性,我们认为体壁中的蛋白酶抑制剂可能是通过抑制真菌的体壁降解蛋白酶活性,来减缓真菌对昆虫体壁的穿透过程。为了进一步研究蛋白酶抑制剂能否增强家蚕的抗真菌能力,我们将蛋白酶抑制剂BmSPI38和BmSPI39重组蛋白作为球孢白僵菌孢子悬液的添加剂,通过体表浸泡法处理家蚕。单独应用球孢白僵菌或与BSA、BmSPI38或BmSPI39等一起处理家蚕。实验结果表明,随着攻毒后时间的增加,家蚕的累积发病率逐渐增加。截止到第5天,单独使用球孢白僵菌攻毒的家蚕累积发病率为64.67%,而使用BSA、BmSPI38或BmSPI39重组蛋白添加剂的的家蚕累积发病率分别为44.44%、18%和8%。我们对攻毒处理第5天的家蚕进行观察,发现单独使用球孢白僵菌和以BSA作为添加剂的处理组,多数家蚕表现为：体壁出现黑色破损病斑,体色加深无光泽,体表脱水下陷,活动性差,触摸感觉迟钝等现象。而蛋白酶抑制剂BmSPI38或BmSPI39的重组蛋白的处理组中,多数家蚕没有明显的发病征兆。家蚕体壁出现黑色斑点,说明家蚕体壁中存在酚氧化酶级联系统,当球孢白僵菌感染家蚕时,会激活家蚕的黑化反应,从而参与抵御真菌的免疫应答。意外的是,蚕蛹节间膜没有发现明显的黑色斑点,这可能是由于节间膜处缺乏酚氧化酶级联系统,不能有效激活黑化反应。通过对五个不同处理组的生存率进行统计分析,发现BmSPI38和BmSPI39都能够显着提高家蚕的生存率,表明蛋白酶抑制剂能够增强家蚕的抗真菌能力,可以作为提高家蚕抗性的靶标基因。4.蛋白酶抑制剂BmSPI38和BmSPI39的抑制特异性关键位点分析家蚕蛋白酶抑制剂与其它物种的TIL类蛋白酶抑制剂的多序列比对结果表明,BmSPI38和BmSPI39的氨基酸序列中有两个半胱氨酸发生了替换,因此,我们推测这两个位置的氨基酸残基是决定其抑制活性的关键位点。利用定点突变技术将这两个位置的Asp和Leu分别突变为Cys。我们对BmSPI39突变前后的三维结构进行了建模预测。结果表明,BmSPI39中只含有2个反平行的β折叠片和一个小α螺旋,其余区域都是柔性的loop区域。整个结构中含有四对二硫键（Cys29-Cys62、 Cys40-Cys5、Cys44-Cys92和Cys64-Cys76）,它们维持了蛋白刚性结构的稳定,使大片的柔性loop区域形成一个相对紧凑而又具有一定柔性的稳定结构。将BmSPI39与突变后的BmSPI39Mu的三维结构进行叠合比较发现,新突变的两个Cys分别位于相邻的两个loop区域,它们会形成一个分子内二硫键,并将相邻的两个loop区域拉近,同时,Thr36m-O和Thr61m-N形成一对氢键以稳定该结构的变化。新生成的二硫键（Cys38m-Cys58m）与相邻的二硫键（Cys40m-Cys54m）一起形成一个稳定的刚性区域,P1残基Ala56m正好处于这个刚性区域中间。将BmSPI38和BmSPI39中的两个氨基酸定点突变为半胱氨酸,突变后的BmSPI38Mu和BmSPI39Mu对枯草杆菌蛋白酶类的抑制活性大大降低,表明这两个位置的半胱氨酸替换是BmSPI38和BmSPI39获得抑制微生物蛋白酶能力的一个重要原因。然而,BmSPI38Mu和BmSPI39Mu没有获得对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶等的抑制能力,推测P1残基在决定其抑制特异性中起重要作用。通过对TIL家族蛋白酶抑制剂活性位点及半胱氨酸数目进行分析,蛋白酶抑制剂的抑制特异性与TIL结构域中的半胱氨酸数目和P1残基性质及大小存在很大的关联。本研究表明,在进化过程中,家蚕TIL家族蛋白酶抑制剂中P1残基替换为小分子的中性氨基酸,使其获得了一定程度的抑制微生物蛋白酶活性的能力,半胱氨酸的替换增强了其抑制的活性和特异性。5.BmSPI38和BmSPI39体内存在形式的分析及在茧壳保护中的功能研究利用还原与非还原SDS-PAGE电泳、MALDI-TOF MS和胶内活性染色技术,我们对BmSPI38和BmSPI39重组蛋白的存在形式进行了分析。结果发现,BmSPI38和BmSPI39重组蛋白主要以多聚体形式存在。Western blot结果表明,BmSPI38和BmSPI39主要以四聚体形式分布于各组织器官中,可能以多聚体形式在家蚕中执行功能。RT-PCR及Western blot结果表明,BmSPI39在5龄第5天家蚕的前部和中部丝腺特异表达,推测BmSPI39可能参与丝腺相关的某种过程。BmSPI39在上蔟前的丝腺中高量表达,并随着泌丝过程进入茧壳中。我们的研究表明,蛋白酶抑制剂BmSPI39能够通过抑制微生物蛋白酶对茧壳蛋白的水解过程,从而为预蛹和蛹提供长效有力的保护。
秦宗华[7]（2013）在《血浆蛋白纯化技术的研究》文中研究指明离子交换色谱是主要依赖于不同蛋白分子与交换剂结合力不同，而进行的一种简单、快速有效的用于蛋白分离纯化的技术，具有高容量、低成本的优点。动物血浆（血清）中含有种类丰富的蛋白质，这些蛋白质对于维持机体的生理活动具有重要意义。本研究主要通过Q SepharoseTM–XL强阴离子交换色谱技术，结合分子排阻色谱等建立对血浆中免疫球蛋白、白蛋白以及抗凝血酶等进行分离纯化的方法。动物血清中免疫球蛋白和白蛋白的等电点分别约为7.8和4.8，根据它们等电点的较大差别，采用pH分段洗脱方式，利用Q SepharoseTM–XL强阴离子交换色谱结合分子排阻色谱同时分离纯化这两种蛋白。对纯化后的蛋白进行活性检测，证明所纯化的免疫球蛋白和白蛋白都保持正常的生物活性。蛋白质含量测定说明免疫球蛋白的纯化回收率达到95%以上，而白蛋白的回收率大于90%。该法简便快速，可同时从动物血清中纯化出保持生物活性的免疫球蛋白和白蛋白，纯化效率高。以市场上购买的精氨酸激酶为抗原进行动物免疫，利用Q SephroseTM-XL强阴离子交换色谱从高免疫兔血清中纯化精氨酸激酶的多克隆抗体，再分别采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和间接酶联免疫法进行纯度和活性的检测。纯化出的多克隆抗体具有纯度高、活性强的特点，这对于未来多克隆抗体的研究具有深远意义。血浆中抗凝血酶是体内最重要的抗凝血物质，正常含量一般维持在150mg/L200mg/L水平。本研究分别采用肝素钠亲和色谱和Q SephroseTM-XL强阴离子交换色谱对血浆中抗凝血酶粗提液进行分离纯化。通过SDS-PAGE进行目标蛋白分子量和纯度检测，得出分子量约为58KDa，与标准抗凝血酶样品分子量大小相符，且纯度较高。
叶韵[8]（2012）在《黄粉虫丝氨酸胰蛋白酶样酶基因克隆与原核表达研究》文中研究指明随着社会发展以及人们生活水平的提高,由血栓引起的血栓性疾病是一种常见心脑血管病。每年在我国需要进行血栓溶解治疗的人就超过300万,而死于心脑血管疾病的人每年大约为200万,占总因病死亡人数的40.7%,与癌症相比,位于各类死因之首。因此,作为威胁人类健康的疾病,心脑血管疾病已成第一位。溶栓剂作为一种治疗血管疾病的抗栓药物,其作用机理主要通过激活纤维蛋白溶解酶原活化成为纤维蛋白溶解酶,使之催化血栓的基质纤维蛋白水解；另外一些溶栓剂也可直接水解纤维蛋白,同样使血管再次通畅。及时给予溶栓剂的治疗,使闭塞血管再通,重要脏器迅速获得血液再灌注,扼制脏器衰竭的发生是很好的治疗方法。因此,效果良好、溶血副作用小的溶血栓药物的寻找和研制,对于有效地治疗和拯救人类于心脑血管疾病具有十分重要的意义。黄粉虫（Tenebrio molitor L.）。体内多种蛋白质、氨基酸、脂肪、微量元素和维生素等物质,经实验证明,以黄粉虫为原料制成的保健品可提高人体免疫力,抗疲劳,降低血脂,抗癌,促进新陈代谢等功效。国内主要研究其在饲料中应用,作为一种高蛋白营养品,对其蛋白的功能以及功能性蛋白的研究较少。在国外,现阶段对黄粉虫丝氨酸胰蛋白酶样酶的提取、功能,以及其基因方面的研究不多,而对该基因的克隆表达的研究还没出现。本研究是对黄粉虫丝氨酸胰蛋白酶样酶（TMTLSP）进行全基因克隆以及原核表达。首先,分别利用异硫氰酸胍法和柱式小量提取法提取黄粉虫总RNA,比较两种提取方法在含量、纯度、完整度上的优异,以获得高质量的黄粉虫总RNA,为下一步实验做准备。然后,参照地鳖（Eupolyphaga sinensis）纤溶酶（fibrinolytic enzyme）基因序列的简并引物,进行温度梯度PCR。以得到的扩增产物为基础,采用Rapid Amplification of cDNA Ends （RACE）法扩展蛋白基因全长cDNA,并命名为黄粉虫丝氨酸胰蛋白酶样酶（Tenebrio molitor Trypsin-like Serine Protease, TMTLSP）。 TMTLSP全长为869bp（GenBank序列号为JN662461）,开放阅读框为777bp,编码258个氨基酸,并具有Trypsin-like特有的起始位点、活性中心以及预计底物结合位点。经过比对分析,该基因编码的氨基酸序列与多种昆虫如赤拟谷盗、谷蠹、光亮扁角水虻、美洲大蠊的胰蛋白酶或丝氨酸蛋白酶有较高的相似性。同时对利用pET28a（+）、大肠杆菌BL21原核表达体系对黄粉虫胰蛋白酶样酶进行原核表达,再进行目标蛋白的纯化以及初步复性。为丝氨酸胰蛋白酶样酶的提取以及研究提供更为广泛的研究材料以及研究依据。
李秋菊,王巍,马红霞,高云航,高见[9]（2011）在《抗凝血酶概述》文中研究表明抗凝血酶亦称肝素辅助因子,是血浆凝血系统中一种重要的生理性丝氨酸蛋白酶抑制物。蚊虫在吸血过程中其唾液腺分泌一组抗凝血活性物质,这些物质不仅可干扰宿主的凝血反应和炎症反应,更是一组具有潜在药理活性的物质。论文对抗凝血酶及蚊虫抗凝血酶的分离与纯化、克隆与表达、活性测定及抗凝血酶药物的研究进展进行综述,为抗凝血酶的深入研究提供参考。
冀颖[10]（2011）在《哈茨木霉Th-33ThChsC基因的克隆及功能初步分析》文中研究表明哈茨木霉（Trichoderma harzianum）是一类具有生防潜力的丝状真菌,其厚垣孢子制剂为其未来最具潜力的开发方向。厚垣孢子显着特征为细胞壁增厚,而几丁质作为菌丝及孢子细胞壁的主要成分,对维持细胞的结构和功能具有重要作用,其合成关键酶为几丁质合成酶（chitin synthase, CS, EC 2.4.1.16）。因此,研究木霉菌几丁质合成酶基因,探索几丁质合成机制,对于研究细胞壁形成过程,进而开发以厚垣孢子为主要成分的木霉菌制剂具有重要意义。本文通过扩增哈茨木霉中的几丁质合成酶基因,构建几丁质合成酶突变体,观察表型变化,初步探究其功能,结果如下:1.克隆几丁质合成酶基因ThChsC片段及其全长将NCBI上注册的23株丝状真菌几丁质合成酶基因的序列进行blast比对,找到保守序列,以此为基础设计简并引物,以哈茨木霉基因组作为模板,进行PCR扩增得到长度为372bp的序列。在NCBI上进行Blast比对,发现与申克孢子丝菌（Sporothrix schenckii）的几丁质合成酶基因（L24910.1）相似性为91%。故在此基础上进行染色体步移,共扩增得到4110bp。2.生物信息学分析几丁质合成酶基因ThChsC序列生物信息学比对结果表明ThChsC （GenBank登录号HQ419000）,编码区（CDS）长为2835bp,由4个外显子和3个内含子组成,开放阅读框（ORF）长2688bp,编码895个氨基酸。进行序列比对及同源性分析显示,该基因与串珠状赤霉（Gibberella moniliformis, ACY08039.1）和禾生刺盘孢菌（Colletotrichum graminicola, AAL23718.1）几丁质合成酶基因相似性最高,分别为80%、81%;相应的氨基酸序列同源性均为80%,系统进化分析表明ThChsC属于III型几丁质合成酶亚家族。ThChsC含有1个Chitinsynth1结构域,1个Chitinsynth1N结构域,1个Chitinsynth2结构域,3个跨膜结构域,为膜结合蛋白。预测三维结构表明其含有糖基转移酶的保守DHD结构域。3.构建几丁质合成酶基因ThChsC突变体以潮霉素基因作为筛选标记,在其两侧插入ThChsC的5’-侧翼序列（长度为1417bp）和ThChsC的3’-侧翼序列（长度为1024bp）作为同源臂;采用酶切-连接法,将构建的重组片段与双元载体pDHt/sk相连构建打靶载体pDHt/ThChsC::hph;采用农杆菌介导转化法（ATMT）将打靶载体导入哈茨木霉Th-33基因组中,根据同源重组原理,使潮霉素基因表达盒替换ThChsC,共得到162株假定转化子。经过连续五次传代培养后,116株仍具有潮霉素抗性,转化效率达到71.6%。4.筛选几丁质合成酶基因ThChsC敲除突变体通过扩增3’和5’侧翼序列以及被敲除的序列,筛选得到几丁质合成酶基因ThChsC敲除突变体6-2;以潮霉素基因为探针,以敲除突变株6-2以及具有表型差异的转化子4-1,3-3,2-2,5-1,3-2,2-9与野生型基因组DNA为模板,进行southern blotting分析,检测T-DNA插入情况。5.分析几丁质合成酶基因ThChsC敲除突变体6-2的表型变化情况以野生型菌株为对照,将菌丝进行Fluorescent Brightener 28染色后,荧光显微镜下观察发现,野生型菌株菌丝内部染色均匀且深,在隔膜处染色更深,而突变体菌丝中染色较浅,说明ThChsC缺失后,几丁质合成量明显减少。此外,显微观察发现,突变体6-2的菌丝内部径向膨大形成厚垣孢子;分生孢子梗分支减少,长度增长;但生长速度,产色素量,产孢量与野生型没有明显区别。
二、埃及伊蚊抗凝血因子Xa基因片段的克隆测序（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、埃及伊蚊抗凝血因子Xa基因片段的克隆测序（论文提纲范文）
（1）PxSerpin-7调控小菜蛾免疫与发育的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 昆虫免疫系统 |
| 1.1.1 体液免疫 |
| 1.1.2 细胞免疫 |
| 1.2 昆虫生长发育 |
| 1.2.1 保幼激素概述 |
| 1.2.2 蜕皮激素概述 |
| 1.3 昆虫免疫与发育相关性 |
| 1.4 丝氨酸蛋白酶抑制剂概述 |
| 1.4.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂的功能 |
| 1.4.2 丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构与作用机制 |
| 1.5 小菜蛾概述 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 供试昆虫 |
| 2.2 质粒与菌株 |
| 2.2.1 细菌的培养 |
| 2.2.2 真菌的培养 |
| 2.3 实验试剂及溶液 |
| 2.3.1 主要实验试剂 |
| 2.3.2 主要培养基的配置 |
| 2.3.3 主要溶液的配置 |
| 2.4 主要仪器设备 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 小菜蛾不同发育阶段的转录组及蛋白质组学关联分析 |
| 3.2 Px Serpin-7 基因CDS片段的克隆 |
| 3.2.1 引物设计 |
| 3.2.2 Px Serpin-7 基因CDS的 PCR扩增 |
| 3.2.3 PCR产物的回收 |
| 3.2.4 目的片段与载体连接 |
| 3.2.5 感受态细胞的制备 |
| 3.2.6 重组质粒的转化 |
| 3.2.7 重组子的筛选及保存 |
| 3.3 Px Serpin-7 基因的结构与序列分析 |
| 3.4 小菜蛾幼虫的解剖及cDNA模板的获取 |
| 3.4.1 小菜蛾幼虫不同组织解剖 |
| 3.4.2 小菜蛾RNA的提取 |
| 3.4.3 cDNA模板的合成 |
| 3.5 Px Serpin-7 表达模式分析 |
| 3.5.1 Px Serpin-7 时空表达模式分析 |
| 3.5.2 Px Serpin-7 微生物诱导表达模式分析 |
| 3.6 原核表达及多克隆抗体制备 |
| 3.6.1 原核表达重组质粒的构建 |
| 3.6.2 重组蛋白的诱导表达及纯化 |
| 3.6.3 多克隆抗体的制备及验证 |
| 3.7 PO活力测定及黑化反应实验 |
| 3.7.1 小菜蛾血浆PO活力测定 |
| 3.7.2 小菜蛾血淋巴黑化反应实验 |
| 3.8 Px Serpin-7 基因的RNAi实验 |
| 3.8.1 dsRNA的合成 |
| 3.8.2 Px Serpin-7 RNAi最适时间点的测定 |
| 3.9 Px Serpin-7 蛋白的PULL-DOWN实验 |
| 4 结果和分析 |
| 4.1 小菜蛾不同发育阶段的蛋白质组与转录组关联分析结果 |
| 4.2 Px Serpin-7 基因CDS片段的克隆结果 |
| 4.3 Px Serpin-7 基因的结构与序列分析结果 |
| 4.3.1 Px Serpin-7 基因全长序列分析结果 |
| 4.3.2 Px Serpin-7 蛋白结构3D建模分析结果 |
| 4.3.3 Px Serpin-7 基因序列分析结果 |
| 4.4 Px Serpin-7 表达模式分析结果 |
| 4.4.1 Px Serpin-7 时空表达模式分析结果 |
| 4.4.2 Px Serpin-7 微生物诱导表达模式分析结果 |
| 4.5 Px Serpin-7 原核表达及多克隆抗体制备结果 |
| 4.5.1 Px Serpin-7 原核表达及其纯化结果 |
| 4.5.2 多克隆抗体制备及验证结果 |
| 4.6 PO活力测定及黑化反应实验结果 |
| 4.6.1 小菜蛾血浆中PO的活力测定结果 |
| 4.6.2 血淋巴黑化反应实验结果 |
| 4.7 Px Serpin-7 蛋白的PULL-DOWN实验结果 |
| 4.7.1 PULL-DOWN结果分析 |
| 4.7.2 PULL-DOWN结果与蛋白质组及转录组的关联分析结果 |
| 4.8 Px Serpin-7 基因的RNAi实验结果 |
| 4.8.1 Px Serpin-7 RNAi后现象观察结果 |
| 4.8.2 Px Serpin-7 RNAi沉默效果检测结果 |
| 5 结论与讨论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 讨论 |
| 5.3 展望 |
| 5.4 研究创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A:pMD18-T载体图谱 |
| 附录 B:p Clone007 载体图谱 |
| 附录 C:pET-32a(+)载体图谱 |
| 附录 D:引物详细信息 |
| 附录 E:PULL-DOWN质谱鉴定结果1 |
| 附录 F:PULL-DOWN质谱鉴定结果2 |
| 附录 G:硕士期间参与的科研成果及获得的重要荣誉 |
（2）白纹伊蚊丝氨酸抗凝血AL-71基因的克隆序列分析及原核表达（论文提纲范文）
| 1试验动物 |
| 2方法 |
| 3结果与分析 |
| 4结论与讨论 |
（3）镰形扇头蜱P0基因的克隆及其双链RNA（dsRNA）杀蜱效果的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 概述 |
| 1.1 蜱的概述 |
| 1.2 RNAi及其中双链RNA的吸收机制 |
| 1.3 双链RNA杀蜱效果在昆虫中的应用 |
| 1.4 双链RNA作为杀蜱剂的展望 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第2章 镰形扇头蜱P0基因的克隆 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第3章 镰形扇头蜱P0基因的原核表达和抗血清的制备 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第4章 镰形扇头蜱P0基因的双链RNA（dsRNA）的制备 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第5章 镰形扇头蜱P0基因双链RNA的杀蜱试验 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 全文 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）白纹伊蚊丝氨酸抗凝血AL-174、AL-71基因的克隆及AL-71基因的原核表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 丝氨酸蛋白酶抑制剂概述 |
| 1.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂的种类及其结构 |
| 1.2 丝氨酸蛋白酶抑制剂的作用机制 |
| 第二章 抗凝血物质的研究进展 |
| 2.1 抗凝血酶的研究进展 |
| 2.2 血小板凝集抑制因子的研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 白纹伊蚊丝氨酸抗凝血AL-174基因克隆与分析 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 白纹伊蚊丝氨酸抗凝血AL-71基因克隆与分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 白纹伊蚊丝氨酸抗凝血AL-71基因原核表达载体构建及在大肠杆菌中的表达 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（5）褐飞虱致害性变异相关机理研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 植物抗虫反应 |
| 2. 植物对植食性昆虫抗虫反应的三个层次 |
| 2.1 抗虫反应第一层次 |
| 2.2 抗虫反应第二层次 |
| 2.3 抗虫反应第三层次 |
| 3. 植食性昆虫致害性变异及其形成原因 |
| 3.1 植食性昆虫致害性变异 |
| 3.2 致害性变异的原因 |
| 3.3 共生菌 |
| 4. 昆虫脂肪体及其与致害性的关系 |
| 4.1 昆虫脂肪体与共生菌 |
| 4.2 脂肪体转录组 |
| 5 研究目的与意义 |
| 第二章 褐飞虱两种不同致害性种群脂肪体转录组分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 Mudgo和TN1种群样品解剖、收集和准备 |
| 1.3 总RNA提取与检测 |
| 1.4 cDNA文库构建、Illumina测序组装及信息分析 |
| 1.5 微卫星DNA(Simple Sequence Repeat,SSR)鉴定与分析 |
| 1.6 两转录组差异表达基因分析 |
| 1.7 实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)检验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 总RNA提取结果 |
| 2.2 转录组测序结果 |
| 2.3 SSR寻找结果 |
| 2.4 两种种群脂肪体中差异表达基因分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 第三章 唾液蛋白Nl4777在褐飞虱致害性变异中作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 褐飞虱唾液Nl4777基因克隆及序列分析 |
| 1.3 荧光定量PCR检测Nl4777基因组织分布及时间表达 |
| 1.4 Nl4777 dsRNA合成与纯化 |
| 1.5 荧光定量PCR检测Nl4777 RNAi后mRNA表达水平 |
| 1.6 褐飞虱Nl4777基因dsRNA注射及生测方法 |
| 1.7 褐飞虱取食后水稻中Nl4777蛋白Western Blot检测 |
| 1.8 水稻LISp::GUS突变体GUS活性检测 |
| 1.9 水稻茉莉酸、水杨酸含量测定方法 |
| 1.10 水稻过氧化氢含量测定方法 |
| 1.11 水稻挥发物测定方法 |
| 1.12 稻虱缨小蜂(A.nilapartvatae)选择性 |
| 1.13 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 基因Nl4777克隆及其序列分析 |
| 2.2 褐飞虱Nl4777基因同源性分析 |
| 2.3 褐飞虱Nl4777编码蛋白与其它物种同源蛋白系统进化树构建 |
| 2.4 荧光定量PCR分析褐飞虱Nl4777基因时空表达 |
| 2.5 基因N14777 dsRNA的合成 |
| 2.6 注射Nl4777 dsRNA对褐飞虱Nl4777 mRNA表达水平的影响 |
| 2.7 沉默Nl4777对褐飞虱两种种群死亡率及产卵量的影响 |
| 2.8 褐飞虱取食后水稻中Nl4777蛋白的Western Blot检测 |
| 2.9 沉默Nl4777褐飞虱取食对水稻LISp::GUS突变体GUS活性的影响 |
| 2.10 沉默Nl4777褐飞虱取食对水稻茉莉酸、水杨酸含量的影响 |
| 2.11 沉默N14777褐飞虱取食对水稻过氧化氢含量的影响 |
| 2.12 沉默N14777褐飞虱取食对水稻挥发物的影响 |
| 2.13 沉默N14777褐飞虱取食诱导的水稻挥发物对稻虱缨小蜂的引诱作用 |
| 3 讨论 |
| 第四章 全文总结与今后研究 |
| 全文总结 |
| 下一步研究 |
| 本文的创新点 |
| 参考文献 |
| 附表1 |
| 附表2 |
| 附表3 |
| 附表4 |
| 附表5 |
| 附表6 |
| 附表7 |
| 博士期间的研究成果 |
（6）家蚕蛋白酶抑制剂抵御昆虫致病性真菌入侵的分子机理研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 昆虫致病性真菌 |
| 1.1.1 昆虫致病性真菌的毒力因子 |
| 1.1.2 致病性真菌在人类疾病方面的研究 |
| 1.2 抗真菌研究 |
| 1.3 蛋白酶抑制剂 |
| 1.3.1 蛋白酶抑制剂的分类 |
| 1.3.2 蛋白酶抑制剂在昆虫免疫中的研究 |
| 1.3.3 丝腺中蛋白酶抑制剂的研究 |
| 1.3.4 蛋白酶抑制剂在农业和医学方面的研究 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究背景、目的及意义 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.2.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂BmSPI38和BmSPI39的全长克隆、原核表达及活性测定 |
| 2.2.2 BmSPI38和BmSPI39对真菌体壁降解蛋白酶的抑制及其动力学特征分析 |
| 2.2.3 蛋白酶抑制剂抑制球孢白僵菌的入侵 |
| 2.2.4 蛋白酶抑制剂BmSPI38和BmSPI39的抑制特异性关键位点分析 |
| 2.2.5 BmSPI38和BmSPI39的体内存在形式分析及BmSPI39在茧壳保护中的功能研究 |
| 2.3 研究路线 |
| 第三章 家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂BmSPI38和BmSPI39的全长克隆、原核表达及活性测定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要仪器及试剂 |
| 3.1.3 试剂配制 |
| 3.1.4 实验方法与步骤 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 含有一个TIL结构域的家蚕蛋白酶抑制剂 |
| 3.2.2 BmSPI38和BmSPI39的全长cDNA克隆 |
| 3.2.3 BmSPI38和BmSPI39的原核表达、纯化及活性检测 |
| 3.2.4 BmSPI38和BmSPI39的温度及酸碱稳定性 |
| 3.2.5 BmSPI38和BmSPI39的抑制活性测定 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 BmSPI38和BmSPI39对真菌体壁降解蛋白酶的抑制及其动力学特征分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要仪器及试剂 |
| 4.1.3 试剂配制 |
| 4.1.4 实验方法与步骤 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 BmSPI38和BmSPI39重组蛋白对真菌蛋白酶的抑制活性测定 |
| 4.2.2 BmSPI38与CDEP-1的体外结合 |
| 4.2.3 BmSPI38和BmSPI39对CDEP-1诱导黑化的抑制 |
| 4.2.4 rPPO的体外激活实验 |
| 4.2.5 白僵菌诱导后不同时间点血液中的蛋白变化 |
| 4.2.6 BmSPI38和BmSPI39的时空表达特征分析 |
| 4.2.7 Peptidases_S8家族蛋白酶的序列分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 蛋白酶抑制剂抑制球孢白僵菌入侵家蚕 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 主要仪器及试剂 |
| 5.1.3 试剂配制 |
| 5.1.4 实验方法与步骤 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 BmSPI38和BmSPI39多克隆抗体的纯化 |
| 5.2.2 BmSPI39在白僵菌诱导后的体壁中的表达变化 |
| 5.2.3 BmSPI39在化蛹第3天体壁中的免疫荧光定位 |
| 5.2.4 蛋白酶抑制剂增强家蚕的抗真菌能力 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 蛋白酶抑制剂BmSPI38和BmSPI39的抑制特异性关键位点分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 主要仪器及试剂 |
| 6.1.3 试剂配制 |
| 6.1.4 方法与步骤 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 BmSPI38和BmSPI39定点突变位点选择及BmSPI39的结构模拟 |
| 6.2.2 BmSPI38和BmSPI39定点突变载体的构建 |
| 6.2.3 BmSPI38Mu和BmSPI39Mu的原核表达及纯化 |
| 6.2.4 BmSPI38Mu和BmSPI39Mu的酶活测定及活性染色 |
| 6.2.5 TIL家族蛋白酶抑制剂活性位点及半胱氨酸数目分析 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 BmSPI38和BmSPI39的存在形式分析及BmSPI39在茧壳保护中的功能研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 实验材料 |
| 7.1.2 主要仪器及试剂 |
| 7.1.3 试剂配制 |
| 7.1.4 方法与步骤 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 BmSPI38和BmSPI39重组蛋白的胶内活性染色 |
| 7.2.2 BmSPI38和BmSPI39重组蛋白的还原与非还原电泳分析 |
| 7.2.3 BmSPI38和BmSPI39重组蛋白的活性存在形式分析 |
| 7.2.4 BmSPI38和BmSPI39家蚕中的生理存在形式分析 |
| 7.2.5 BmSPI39从丝腺分泌入茧壳 |
| 7.2.6 茧壳中KI的Western blot分析及胶内活性染色 |
| 7.2.7 茧壳蛋白的体外酶解 |
| 7.3 讨论 |
| 第八章 综合与结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的文章、申请专利及参研课题 |
| 致谢 |
（7）血浆蛋白纯化技术的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1 血浆的主要成分及其纯化进展 |
| 1.1 白蛋白 |
| 1.1.1 白蛋白的结构特征与功能 |
| 1.1.2 血清白蛋白纯化方法的研究进展 |
| 1.2 免疫球蛋白 |
| 1.3 抗凝血酶 |
| 2 离子交换色谱简介 |
| 2.1 离子交换色谱技术原理 |
| 2.2 离子交换色谱介质 |
| 2.3 离子交换色谱的反应机理 |
| 2.4 离子交换色谱的性能指标 |
| 2.4.1 物理性能指标 |
| 2.4.2 化学性能指标 |
| 2.5 离子交换色谱的基本操作过程及其注意事项 |
| 2.5.1 离子交换树脂的预处理 |
| 2.5.2 离子交换色谱装柱、上样以及洗脱 |
| 2.5.3 工作液对分离效果的影响 |
| 2.5.4 流速对分离效果的影响 |
| 2.5.5 离子交换树脂的贮存 |
| 3. 本研究的内容、目的和意义 |
| 第二章 采用强阴离子交换结合分子排阻色谱纯化血清中免疫球蛋白和白蛋白 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 试剂的配制 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 动物免疫与血清收集 |
| 2.4.2 Q SepharoseTM–XL 离子交换色谱柱的准备与平衡 |
| 2.4.3 上样、洗脱与样品电泳鉴定 |
| 2.4.4 SDS-PAGE |
| 2.4.5 BCA 法测定总蛋白含量 |
| 2.4.6 蛋白样品活性检测 |
| 2.4.6.1 白蛋白清除超氧自由基能力的测定 |
| 2.4.6.2 间接 ELISA 方法检测抗体（IgG）活性 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 色谱效果 |
| 3.2 纯化蛋白的回收率 |
| 3.3 纯化蛋白的生物活性 |
| 4 讨论 |
| 第三章 强阴离子交换色谱在虾精氨酸激酶多克隆抗体纯化方面的应用 |
| 1.前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 试剂的配制 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 多克隆抗体的制备 |
| 2.4.1.1 动物免疫 |
| 2.4.1.2 间接 ELISA 法检测血清效价 |
| 2.4.1.3 多克隆抗体的分离纯化 |
| 2.4.2 间接 ELISA 法检测抗体的活性 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 间接 ELISA 检测血清效价 |
| 3.1.1 包被抗原和抗体最佳工作浓度的确定 |
| 3.1.2 血清抗体效价的测定 |
| 3.2 Q SepharoseTM-XL 色谱对血清中抗体的分离纯化 |
| 3.3 间接 ELISA 检测抗体的活性 |
| 4 讨论 |
| 第四章 血浆中抗凝血酶纯化的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 试剂的配制 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 血浆的制备及预处理 |
| 2.4.2 抗凝血酶粗提液的制备 |
| 2.4.3 采用 Q SepharoseTM-XL 阴离子交换色谱纯化抗凝血酶 |
| 2.4.4 采用肝素钠-Sepharose-4B 亲和色谱纯化抗凝血酶 |
| 2.4.4.1 肝素钠-Sepharose-4B 亲和色谱柱的制备 |
| 2.4.4.2 亲和色谱操作 |
| 2.4.4.3 肝素钠含量的测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 肝素钠-Sepharose-4B 亲和色谱柱偶联率的测定 |
| 3.2 色谱效果 |
| 4 讨论 |
| 第五章 总结及展望 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（8）黄粉虫丝氨酸胰蛋白酶样酶基因克隆与原核表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| CONTENTS |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 血栓栓塞性疾病的现状 |
| 1.2 血栓的形成 |
| 1.2.1 机体凝血系统与抗凝血系统 |
| 1.2.2 血栓的形成 |
| 1.3 抗血栓药物 |
| 1.3.1 纤溶酶原激活剂 |
| 1.4 胰蛋白酶 |
| 1.4.1 胰蛋白酶分布 |
| 1.4.2 丝氨酸胰蛋白酶样酶的组成与特性 |
| 1.5 黄粉虫虫抗血栓的实验研究进展 |
| 1.6 本课题研究内容及意义 |
| 1.6.1 研究意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 第二章 不同提取方法提取黄粉虫总RNA |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要试剂及耗材 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 黄粉虫预处理 |
| 2.2.2 黄粉虫总RNA的不同提取方法 |
| 2.2.3 琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 2.2.4 紫外分光光度计检测 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 2.3.2 紫外分光光度计检测 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 黄粉虫丝氨酸胰蛋白酶样酶cDNA全长克隆 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试剂以及试剂盒 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 cDNA第一链 |
| 3.2.2 温度梯度简并PCR获得丝氨酸胰蛋白酶样酶保守序列 |
| 3.2.3 cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA end,RACE) |
| 3.2.4 黄粉虫丝氨酸胰蛋白酶样酶(TMTLSP)全基因克隆 |
| 3.2.5 序列分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 TMTLSP基因保守片段克隆及测序 |
| 3.3.2 3’RACE产物克隆以及测序 |
| 3.3.3 5’RACE产物克隆以及测序 |
| 3.3.4 黄粉虫丝氨酸胰蛋白酶样酶(TMTLSP)全基因克隆及碱基序列初步分析#27 |
| 3.3.5 感受态制备检测结果 |
| 3.3.6 TMTLSP全基因克隆鉴定 |
| 3.3.7 序列分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 3.4.1 黄粉虫丝氨酸胰蛋白酶样酶cDNA全长克隆 |
| 3.4.2 TMTLSP基因碱基分析及编码氨基酸分析 |
| 第四章 黄粉虫丝氨酸胰蛋白酶样酶TMTLSP原核表达 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 材料、菌株以及表达载体 |
| 4.1.2 试剂配方 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 TMTLSP基因片段的制备 |
| 4.2.2 表达载体的制备 |
| 4.2.3 表达载体的构建及筛选 |
| 4.2.4 表达菌株大肠杆菌BL21感受态制备及转化检验 |
| 4.2.5 表达菌株的制备及鉴定 |
| 4.2.6 目标蛋白诱导表达 |
| 4.2.7 表达蛋白鉴定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 双酶切表达载体制备 |
| 4.3.2 大肠杆菌DH5α转化保存表达载体及克隆鉴定 |
| 4.3.3 目标蛋白诱导表达 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 包涵体纯化与复性、目标蛋白的活性检验 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 主要试剂及配方 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 包涵体粗提及变性 |
| 5.2.2 Ni柱纯化目标蛋白 |
| 5.2.3 目标蛋白复性 |
| 5.2.4 纤溶平板测定酶活力 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 SDS-PAGE分析包涵体纯化结果 |
| 5.3.2 SDS-PAGE分析Ni柱纯化结果 |
| 5.3.3 纤溶平板测定酶活力 |
| 5.4 本章小结 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（10）哈茨木霉Th-33ThChsC基因的克隆及功能初步分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 木霉菌防治植物病害的机制 |
| 1.1.1 拮抗作用 |
| 1.1.2 竞争作用 |
| 1.1.3 重寄生作用 |
| 1.1.4 诱导抗性 |
| 1.2 木霉菌防治植物病害的范围 |
| 1.3 木霉制剂的种类 |
| 1.4 几丁质合成酶及其基因的分类 |
| 1.5 几丁质合成酶的功能研究 |
| 1.6 生物信息学在真菌基因功能研究中的应用 |
| 1.6.1 核酸/氨基酸序列数据库的比对和分析 |
| 1.6.2 蛋白质结构数据库的检索与功能预测 |
| 1.7 基因表达与调控的研究策略 |
| 1.7.1 差减杂交（subtractive hybridization SH） |
| 1.7.2 mRNA 差异显示和限制性差异显示 |
| 1.8 基因功能的研究策略 |
| 1.8.1 转座子标签技术 |
| 1.8.2 T-DNA 标签技术 |
| 1.8.3 酵母双杂交技术 |
| 1.8.4 双分子荧光互补技术 |
| 1.8.5 微阵列技术 |
| 1.8.6 超表达技术 |
| 1.8.7 RNAi 技术（RNA interference, RNAi） |
| 1.8.7.1 RNA 干扰技术的发现 |
| 1.8.7.2 RNA 干扰的作用机制 |
| 1.8.7.3 RNA 干扰技术的技术路线 |
| 1.8.7.4 RNAi 技术的特点 |
| 1.8.8 基因敲除技术 |
| 1.8.8.1 基因打靶技术的技术路线 |
| 1.8.8.2 基因敲除的作用特点 |
| 1.9 本实验的研究目的意义、内容及技术路线 |
| 1.9.1 本研究的目的意义 |
| 1.9.2 本研究的主要内容 |
| 1.9.3 本研究的技术路线 |
| 第二章 哈茨木霉几丁质合成酶基因ThChsC 的克隆 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试剂 |
| 2.1.2 菌株 |
| 2.1.3 培养基及主要试剂配方 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.1.5 木霉基因组DNA 的提取 |
| 2.1.6 几丁质合成酶基因的克隆 |
| 2.1.7 几丁质合成酶基因全长序列的生物信息学分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 几丁质合成酶基因片段的获得 |
| 2.2.2 几丁质合成酶基因全长序列的获得及验证 |
| 2.2.3 几丁质合成酶基因全长序列的生物信息学分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 几丁质合成酶基因ThChsC 敲除打靶载体的构建 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试剂 |
| 3.1.2 菌株和质粒 |
| 3.1.3 几丁质合成酶基因ThChsC 侧翼序列的获得 |
| 3.1.4 潮霉素基因表达盒的获得 |
| 3.1.5 双元打靶载体pDHt/ThChsC::hph 的构建 |
| 3.1.6 双元打靶载体pDHt/ThChsC::hph 的分子生物学检测 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 几丁质合成酶基因ThChsC 侧翼序列的获得 |
| 3.2.2 双元打靶载体pDHt/ThChsC::hph 的构建 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 根癌农杆菌介导的哈茨木霉Th-33 转化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试剂 |
| 4.1.2 菌株 |
| 4.1.3 培养基 |
| 4.1.4 双元打靶载体pDHt/ThChsC::hph 转化根癌农杆菌 |
| 4.1.5 根癌农杆菌介导双元打靶载体pDHt/ThChsC::hph 转化哈茨木霉Th-33 |
| 4.1.6 假定转化子的遗传稳定性分析 |
| 4.1.7 假定转化子的分子生物学验证 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 双元打靶载体pDHt/ThChsC::hph 转化根癌农杆菌 |
| 4.2.2 假定转化子的获得及其稳定性分析 |
| 4.2.3 假定转化子的分子生物学验证 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 突变株的表型分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试剂 |
| 5.1.2 菌株 |
| 5.1.3 突变株生长速率和产分生孢子数量的检测 |
| 5.1.4 突变株的荧光染色观察 |
| 5.1.5 突变株的菌丝和分生孢子器形态观察 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 突变株生长速率和产分生孢子数量的检测 |
| 5.2.2 突变株的荧光染色观察 |
| 5.2.3 突变株的菌丝和分生孢子器形态观察 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、埃及伊蚊抗凝血因子Xa基因片段的克隆测序（论文参考文献）
- [1]PxSerpin-7调控小菜蛾免疫与发育的分子机制[D]. 张展滔. 华南农业大学, 2019
- [2]白纹伊蚊丝氨酸抗凝血AL-71基因的克隆序列分析及原核表达[J]. 高云航,李秋菊,娄玉杰,马红霞. 中国兽医杂志, 2015(08)
- [3]镰形扇头蜱P0基因的克隆及其双链RNA（dsRNA）杀蜱效果的研究[D]. 张玉婷. 新疆农业大学, 2015(06)
- [4]白纹伊蚊丝氨酸抗凝血AL-174、AL-71基因的克隆及AL-71基因的原核表达[D]. 李秋菊. 吉林农业大学, 2013(01)
- [5]褐飞虱致害性变异相关机理研究[D]. 禹海鑫. 浙江大学, 2013(01)
- [6]家蚕蛋白酶抑制剂抵御昆虫致病性真菌入侵的分子机理研究[D]. 李游山. 西南大学, 2013(11)
- [7]血浆蛋白纯化技术的研究[D]. 秦宗华. 暨南大学, 2013(01)
- [8]黄粉虫丝氨酸胰蛋白酶样酶基因克隆与原核表达研究[D]. 叶韵. 广东工业大学, 2012(09)
- [9]抗凝血酶概述[J]. 李秋菊,王巍,马红霞,高云航,高见. 动物医学进展, 2011(09)
- [10]哈茨木霉Th-33ThChsC基因的克隆及功能初步分析[D]. 冀颖. 中国农业科学院, 2011(10)