人胰腺癌与端粒酶及其亚基表达的关系

一、人胰腺癌与端粒酶及其亚单位表达的关系（论文文献综述）

戴月娣^[1]（2020）在《KLF2对胰腺癌细胞的生物学行为影响和机制研究》文中进行了进一步梳理胰腺导管癌是一种恶性程度高、病程短、进展快、预后极差的恶性肿瘤,具有复杂的基因组环境。KLF2是Krüppel样因子家族的重要成员,文献报道在多种恶性肿瘤组织中表达下调,与恶性肿瘤关系密切。但是KLF2与胰腺癌的关系未见报道,关系不明确,结合既往研究我们推测KLF2可能协同其他分子参与异常信号通路调节,导致胰腺癌发生、发展。本研究旨在探讨KLF2对胰腺癌细胞生物学行为影响及其机制。第一部分KLF2对胰腺癌细胞的生物学行为影响研究目的探讨KLF2对胰腺癌细胞生长、迁移、体内转移和衰老的生物学行为影响。研究方法免疫组化法、Western Blot、RT-PCR法对52例胰腺导管癌组织和配对正常胰腺组织KLF2水平进行检测,观察胰腺癌组织KLF2表达变化,探讨KLF2与胰腺癌发生的关系。真核表达载体转染KLF2至BXPC3和Suit2细胞株,构建稳定生长过表达KLF2的BXPC3和Suit2细胞;RNA干扰的病毒载体感染细胞株,构建稳定生长并低表达KLF2的BXPC3和Suit2细胞。Boyden chamber实验检测过表达和低表达KLF2的BXPC3和Suit2细胞的迁移能力,结晶紫法检测过表达和低表达KLF2细胞的增殖生长能力。Lipofectamine 2000载体转染HPAC细胞和SW1990,构建稳定生长的过表达KLF2细胞;RNA干扰病毒载体感染HPAC细胞和SW1990,构建稳定生长的低表达KLF2细胞。SA-β-gal染色检测过表达和低表达KLF2对HPAC和SW1990细胞衰老影响。荧光素酶基因标记低表达KLF2的BXPC3细胞注入裸鼠心脏,检测肿瘤转移光子数变化;裸鼠皮下种植过表达KLF2的SW1990细胞,测定肿瘤大小计算肿瘤体积,处死小鼠测肿瘤重量;观察KLF2表达对肿瘤体内生长和转移的影响。分离PDX-Cre KrasG12D（KC）小鼠胰腺组织,建立胰腺癌类器官,Lipofectamine 2000作为载体建立过表达KLF2的类器官,体外观察过表达KLF2对胰腺癌类器官生长影响。研究结果与正常胰腺组织相比,胰腺导管癌组织中KLF2 m RNA水平下降、KLF2免疫组化染色阴性增多、KLF2蛋白水平下调。敲减KLF2的BXPC3和Suit2细胞克隆形成和迁移能力增强,低表达KLF2的HPAC细胞和SW1990衰老细胞比例减少,低表达KLF2的BXPC3细胞在裸鼠体内转移光子信号更多。高表达KLF2的BXPC3和Suit2细胞的克隆形成和迁移降低;高表达KLF2的HPAC和SW1990细胞衰老细胞比例更高;高表达KLF2的SW1990细胞裸鼠皮下移植瘤体积更小、重量更轻。高表达KLF2的胰腺癌类器官生长大小更小、数量少。研究结论KLF2低表达与胰腺导管癌发生相关。KLF2高表达能够抑制胰腺癌细胞体外生长、迁移和体内生长转移,并诱导细胞衰老,抑制胰腺癌干细胞生长;KLF2低表达能够促进胰腺癌细胞体外生长、迁移和体内生长转移,并抑制细胞衰老。第二部分KLF2抑制胰腺癌的机制研究研究目的探讨KLF2调控胰腺癌细胞生长、迁移、体内转移和衰老等生物学行为改变的机制。研究方法采用报告基因检测法分析过表达KLF2对β-catenin/TCF转录活性及其信号通路下游部分靶基因影响,探讨KLF2通过调控β-catenin/TCF信号抑制胰腺癌机制。Western Blot法及q PCR法测定KLF2变化对细胞衰老标记物p21蛋白及m RNA表达变化,阐明KLF2通过诱导胰腺癌细胞发生衰老抑制胰腺癌。免疫沉淀后质谱法鉴定KLF2的结合蛋白,纯化GST-KLF2融合蛋白进行GST pull-down实验,探讨内源性FOXO4与KLF2的相互作用;免疫共沉淀检测外源性FOXO4是否与KLF2形成复合物,探讨外源性FOXO4与KLF2的相互作用。敲减FOXO4检测KLF2变化,结合敲减KLF2检测FOXO4变化,Western Blot法检测过表达和低表达KLF2、FOXO4对p21表达影响,SA-β-gal染色检测过表达和低表达KLF2、FOXO4对细胞衰老影响,探讨KLF2与FOXO4通过调控衰老抑制胰腺癌机制。过表达KLF2的HPAC细胞分别敲减FOXO4或p21,SA-β-Gal染色软琼脂实验观察衰老细胞克隆形成,观察敲减FOXO4和p21对细胞衰老的挽救作用。芯片实验检测KLF2和FOXO4与p21启动子的结合,Flag分别标记KLF2的AD、ID和ZF结构域后转染SW1990细胞,免疫沉淀Western Blot法检测KLF2与FOXO4结合的结构域,定位KLF2发挥抑制功能的结构区域。研究结果KLF2过表达可抑制氯化锂（Li Cl）诱导的Topflash报告基因激活,KLF2过表达可与β-catenin/TCF结合直接抑制其转录活性,也可下调β-catenin/TCF下游c-Jun、c-Myc、cyclin D1和Snail基因表达,抑制β-catenin/TCF信号通路。过表达KLF2诱导衰老特异标记物p21蛋白和m RNA水平显着升高;敲减KLF2后的胰腺癌细胞衰老减少,p21蛋白和m RNA水平降低。KLF2可与内源性FOXO4相互作用,与外源性FOXO4形成复合物,KLF2和FOXO4可通过与p21启动子结合协同诱导p21蛋白表达,共同诱导胰腺癌细胞衰老。敲减FOXO4和p21对KLF2诱导细胞衰老具有挽救作用。KLF2的AD区介导KLF2与FOXO4的相互作用,ID和ZF不能协同FOXO4诱导p21的表达,并且与FOXO4的共表达可能抑制FOXO4单独诱导p21表达作用,提示ID和ZF突变体为负调节因子。研究结论KLF2可直接与β-catenin/TCF结合抑制其转录活性、也可通过抑制其下游基因表达,抑制Wnt/β-catenin信号通路后抑制胰腺癌。KLF2还可直接诱导p21表达,或与FOXO4结合协同诱导p21表达,诱导胰腺癌细胞衰老抑制胰腺癌。KLF2结构域的AD区与FOXO4绑定起正调节作用,ID和ZF突变体与FOXO4结合起负调节作用。调低FOXO4和p21表达能挽救KLF2诱导的胰腺癌细胞衰老。

薛福龙^[2]（2014）在《胰腺癌组织端粒酶逆转录酶的表达与临床病理的关系研究》文中指出目的研究胰腺癌组织端粒酶逆转录酶（hTERT）的表达与临床病理的关系。方法回顾性分析我院在2009年6月至2014年2月间收治的46例胰腺癌患者的临床资料,对胰腺癌病灶大小、具体部位与临床分明、组织分级进行描述。利用SABC免疫组化,对hTERT表达进行检测。同时取46例患者癌旁组织进行对照。结果经研究发现,患者肿瘤部位和hTERT表达无关联（P>0.05）。通过对胰腺癌患者胰腺组织观察可得知,有39例患者呈现hTERT表达为阳性,阳性率为84.8%,在癌旁组织中,有12例标本呈现为阳性,阳性率为26.1%。hTERT表达在临床分期中具有统计学意义（P<0.05）,其在Ⅰ期的hTERT表达阳性率最低,明显低于Ⅲ期和Ⅳ期。它与肿瘤分级、大小、位置无关联。结论人端粒酶逆转录酶在胰腺癌组织中表达较高,它的表达与肿瘤临床分期有很大关联,这表明hTERT表达在肿瘤组织与癌旁组织中的表达差异非常大。

高世勇,王珑^[3]（2014）在《冬凌草的化学和药理作用研究》文中进行了进一步梳理介绍冬凌草的化学成分、药理作用、抗肿瘤机制、临床应用等方面的研究成果.通过文献系统地介绍了国内外目前关于冬凌草的研究.研究发现冬凌草中含有萜类、生物碱、甾体、黄酮、挥发油、氨基酸、有机酸、单糖等化学成分,并具有抗肿瘤、抗菌消炎、免疫增强、抗氧化、抗突变、降压等药理作用,而其抗肿瘤机制包括阻遏细胞周期、下调端粒酶活性、抑制细胞膜钠泵活性、诱导肿瘤细胞凋亡、逆转多药耐药等,在临床上对食管癌、贲门癌、肝癌、乳腺癌等多种癌症均具有疗效.表明冬凌草具有广泛的药理作用和良好的抗癌活性.

孙大伟^[4]（2013）在《MUC1、DPC4基因及端粒酶基因在胰腺癌中的表达及临床意义》文中认为目的：探讨黏蛋白1（MUC1）基因、端粒酶基因及胰腺癌缺失基因（DPC4）在在人正常胰腺组织和胰腺癌组织中的表达及临床意义。方法：运用免疫组化SABC法检测MUCl、人端粒酶逆转录酶（hTERT）及DPC4蛋白在47例胰腺癌组织石蜡块和8例正常胰腺组织中的表达情况,分析与病人的性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤发生部位、病理分化程度、是否有淋巴结转移及其TNM分期等指标间的相关性。结果：MUC1、人端粒酶逆转录酶（hTERT）及DPC4在8例正常胰腺组织中的阳性表达率分别为25.0%、12.5%、100%,在47例人胰腺癌组织中的阳性表达率分别为78.72%、76.60%和55.32%,两组之间存在明显差异（P＜0.05）。在人胰腺癌组织中,MUC1的表达在有无淋巴转移中有明显差异（P<0.05）; hTERT的表达在组织的分化程度和是否有淋巴转移中的差异有统计学意义（P<0.05）。DPC4在胰腺癌组织中的阳性表达率与胰腺癌临床特征间差异均无统计学意义（P>0.05）。MUC1、hTERT及DPC4三者在胰腺癌组织中的表达无相关关系（P＞0.05）。结论：MUC1、hTERT在胰腺癌组织中表达增多,DPC4在胰腺癌表达减少,这三者表达的改变在胰腺癌的发生、发展和转移中可能起着重要作用。三者联合检测有助于胰腺癌的早期诊断。

周丽娜^[5]（2013）在《一种新的hTERT相互作用蛋白的筛选及鉴定》文中认为目的和意义：端粒-端粒酶与细胞增殖、分化及衰老等增龄相关性疾病密切相关。端粒封闭染色体末端并维持染色体的稳定性，它随细胞分裂增殖而成比例的丢失，从而导致细胞衰老及死亡；端粒酶的活化，可以以其自身RNA组分（Human telomerase RNA, hTR）为模板，通过端粒酶催化亚单位（Human telomerase reverse transcriptase, hTERT）催化合成并延长端粒，补偿端粒的丢失，维持基因组的稳定，从而满足机体补充、修复及更新的需要。端粒酶的活性决定端粒的长度进而控制细胞的命运，其活性异常可以使细胞凋亡失控、失衡或永生化，进而可导致一系列增龄性疾病，如动脉硬化性心脑血管疾病、2型糖尿病、原发性骨质疏松症和肿瘤等。因此，端粒酶活性调控已成为目前的研究热点：诱导端粒酶活性，可以延长正常细胞增殖和寿命，抑制端粒酶活性，可以导致异常细胞凋亡和衰老。进一步深入了解端粒酶活性调控机制可以为增龄相关性疾病的发病机理和防治机制以及制备治疗性生物工程细胞和干细胞等研究提供新的思路和线索。端粒酶的活性调控是涉及多因子参与多水平调节的复杂过程，hTERT是端粒酶活性的必需组分和关键限速成分，其调控涉及hTERT基因的转录，hTERTmRNA的适当剪接，hTERT蛋白质翻译后修饰，细胞内转运以及将全长的hTERT蛋白组装为全酶等，这一系列细胞内生物事件的正常发挥依赖于hTERT和其结合蛋白的相互作用，对hTERT相互作用蛋白的挖掘研究，有助于更深入探索端粒酶的结构功能以及活性调控作用机制。蛋白质组学技术和生物质谱技术的迅速发展及其有效结合，为研究蛋白质相互作用提供了强大手段，其准确性高与速度快的优点使免疫共沉淀联合质谱分析技术已被广泛应用于寻找生理条件下新的相互作用。本课题研究将免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation, Co-IP）与串联芯片液相质谱（High Pressure LiquidChromatography, Chip Hermeticity In Plastics, Mass Spectrum, HPLC-CHIP-MS-MS）有效结合，鉴定出新的hTERT相互作用蛋白原钙粘附蛋白10（Protocadherin10, PCDH10），并对两者的相互作用所介导的端粒酶活性和肿瘤细胞生物学特性等生物学效应进行初步研究。主要研究内容和结果：1.免疫共沉淀联合质谱技术筛选hTERT相互作用蛋白1.1hTERT免疫共沉淀复合物的获取、分离和质谱鉴定首先获取经行“双侧睾丸切除术”的前列腺癌患者的新鲜睾丸组织，病理证实为正常睾丸组织；Lysis/Wash Buffer裂解获得睾丸组织总蛋白；采用Co-IP Kit利用抗人hTERT单抗免疫共沉淀睾丸组织总蛋白（以IgG为对照抗体），获得hTERT免疫共沉淀复合物；经Western Blotting证实免疫共沉淀复合物中hTERT的存在，而对照组中没有，同时经SDS-PAGE凝胶电泳分离hTERT免疫共沉淀复合物，考马斯亮蓝染色显示与对照组IgG相比，有hTERT蛋白条带（约120KD）及目的特异性条带存在，证明此法可行；切取2条差异条带经胶内酶解后，通过HPLC-CHIP-MS-MS在高可信度Valid模式下鉴定为PCDH10和SP1。SP1为已报道的hTERT激活的关键转录因子，因此我们选择新的hTERT相互作用蛋白PCDH10进行下一步研究。1.2hTERT和PCDH10相互作用的免疫共沉淀体内验证分别选用抗人hTERT单抗（或抗人PCHD10单抗）进行Co-IP（以不加抗体为对照），然后以抗人PCHD10单抗（或抗人hTERT单抗）进行Western Blotting检测，结果显示以hTERT单抗免疫共沉淀复合物中有PCDH10的存在，而以PCDH10单抗免疫共沉淀复合物中有hTERT的存在，再一次验证两者的相互作用，证明质谱结果的真实性。2. PCDH10和hTERT相互作用对端粒酶活性的影响2.1腺病毒Ad-PCDH10的构建、包装及扩增采用RT-PCR从睾丸组织中扩增PCDH10基因全长片段，连接至中间载体pTA2，经酶切及测序鉴定正确；KpnI和XbaI同时双酶切PCDH10的基因序列和腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV，T4连接酶连接后连接产物转化感受态DH5α，获取重组腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-PCDH10；经PmeI线性化后在含pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态中进行同源重组，获得重组腺病毒载体pAdEasy-PCDH10；转染293T细胞进行包装、扩增，第5代获得滴度较高的腺病毒，命名为Ad-PCDH10。2.2PCDH10和hTERT相互作用对端粒酶活性的影响以端粒酶强阳性的体外培养肿瘤细胞为研究对象，腺病毒Ad-PCDH10和腺病毒空载Ad感染人胰腺癌细胞HS766T，同时设置未感染对照组。Real-Time PCR和Western Blotting分别检测HS766T细胞中PCDH10的mRNA和蛋白表达水平表明：转染PCDH10基因后，与腺病毒空载对照组和未感染对照组相比，PCDH10基因表达明显上调，蛋白表达明显增强（P<0.01），证明腺病毒感染有效。（1） Real-Time PCR和Western Blotting分别检测HS766T细胞中hTERT的mRNA和蛋白表达水平表明：转染PCDH10基因后，hTERT的mRNA和蛋白表达水平较腺病毒空载对照组和未感染对照组无明显变化（P>0.05），表明PCDH10对hTERT的表达没有影响；（2）以抗人PCDH10单抗免疫共沉淀HS766T细胞总蛋白，Western Blotting检测hTERT存在于转染PCDH10的免疫共沉淀复合物中，同时TRAP-非变性PAGE-银染法检测端粒酶活性提示：转染PCDH10基因组的端粒酶活性较腺病毒空载对照组和未感染对照组明显降低（P<0.01），而后两者端粒酶活性无明显差异（P>0.05），表明PCDH10与hTERT相互作用能明显抑制端粒酶活性。3. PCDH10对肿瘤细胞增殖、周期、迁移和侵袭等生物学特性的影响腺病毒Ad-PCDH10和腺病毒空载Ad感染HS766T，同时设置未感染对照组。3.1PCDH10转染对HS776T细胞增殖活性的影响转染PCDH10基因24h，48h，72h，96h，120h，144h后，CCK-8细胞增殖检测各组细胞增殖活性。结果显示：腺病毒空载对照组与未转染组比较，HS776T细胞增殖率无明显改变（P>0.05），表明腺病毒空载体转染对HS776T细胞的增殖活性无影响；与腺病毒空载对照组相比，转染PCDH10组的细胞增殖率逐渐下降，表明PCDH10对HS766T细胞增殖起抑制作用，并呈时间依赖性，转染96h增殖率下降12.73%（P<0.05）；转染120h增殖率下降19.87%（P<0.01）；转染144h增殖率最低，抑制最强，下降30.14%（P=0.000）。3.2PCDH10转染对HS776T细胞周期的影响转染PCDH10基因72h，流式细胞仪DNA含量分析法检测各组细胞周期。结果显示：与未感染组和腺病毒空载组比较，PCDH10组细胞增殖期（S、G2/M期）细胞和静止期（G0、G1期）各细胞周期比例均无明显变化（P>0.05），表明PCDH10对HS776T的细胞周期没有影响。3.3PCDH10转染对HS776T细胞迁移能力的影响转染PCDH10基因24h，48h后，采用细胞划痕实验测定细胞迁移能力。结果显示：与未感染组比较，腺病毒空载组24h和48h细胞的迁移率无明显差异（P>0.05），表明腺病毒空载转染对HS776T细胞的迁移活性无影响；而转染PCDH10基因组划痕处的HS776T细胞的迁移明显受抑制，24h和48h细胞的迁移率较腺病毒空载对照组明显下降（P<0.01），分别下降30.07%和52.95%（P=0.000），表明PCDH10能明显抑制HS776T细胞的迁移能力。3.4PCDH10转染对HS776T细胞侵袭能力的影响转染PCDH10基因24h，采用Transwell实验测定细胞侵袭能力。结果显示：与未感染组比较，腺病毒空载组细胞24h穿过Matrigel胶及Transwell膜的细胞数无明显差异（P>0.05），表明腺病毒空载体转染对HS776T细胞的侵袭活性无影响；而转染PCDH10基因组与腺病毒空载组相比，HS776T细胞侵袭重建基底膜能力受到显着的抑制，穿过Matrigel胶及Transwell膜的细胞数明显减少（P<0.01），侵袭活性下降58.56%（P=0.000），表明PCDH10能明显抑制HS776T细胞侵袭能力。结论：综上所述，本课题首次从正常人睾丸组织中成功筛选和鉴定出新的hTERT相互作用蛋白PCDH10，并在体内验证hTERT和PCDH10间存在相互作用；其次通过在端粒酶强阳性的肿瘤细胞中过表达PCDH10，体外实验初步阐明PCDH10对hTERT表达无影响，而它与hTERT相互作用抑制端粒酶活性；最后明确PCDH10在体外具有抑制肿瘤细胞生长，降低肿瘤细胞迁移和侵袭等细胞生物学效应；同时推测外源性过表达PCDH10可能通过增强与hTERT的直接相互作用，加强抑制端粒酶活性作用，进而抑制肿瘤细胞生长，降低肿瘤细胞迁移和侵袭，这可能是PCDH10抑癌的重要机制之一。复习文献，迄今未发现PCDH10与端粒酶有关的报道。因此，我们的研究首次明确PCDH10对端粒酶活性起抑制作用，为完善端粒酶活性调控机制提供了新的实验依据和研究方向，并为端粒酶在增龄相关性疾病的发病机理和防治机制以及制备治疗性生物工程细胞等方面提供了新的思路和线索。

邢帅^[6]（2012）在《靶向phTERT-PE38KDEL重组质粒联合硼替佐米抑制裸鼠胰腺癌移植瘤生长的研究》文中进行了进一步梳理目的建立裸鼠皮下胰腺癌移植瘤模型,探讨重组质粒phTERT-PE38KDEL联合硼替佐米对裸鼠胰腺癌移植瘤生长的抑制作用。方法将体外培养的人胰腺癌细胞系MiaPaCa2细胞接种于裸鼠皮下,建立荷人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤动物模型,采用腹腔给药和瘤内注射方式,以硼替佐米联合重组质粒phTERT-PE38KDEL对荷瘤鼠进行联合干预治疗,比较各组肿瘤体积和重量,并计算肿瘤的抑制率,比较各组裸鼠生存期差异。取各组裸鼠肿瘤组织,心,肝,肾组织HE染色,光学显微镜下观察,并联合免疫组化染色法检测核增殖抗原（PCNA）及微血管密度（MVD）, TUNEL染色检测肿瘤的凋亡并计算凋亡指数（AI）,流式细胞学检测各组瘤体细胞凋亡率以及细胞周期动力学改变。结果成功建立4组人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型,联合治疗组（A组）的肿瘤体积及瘤重在每个检测点均小于基因治疗组（B组）、单纯化疗组（C组）和空白对照组（D组）（P<0.01）,与D组相比,A、B、C组肿瘤抑制率分别为68.98%、51.44%、16.39%。组织学观察A组肿瘤组织出现大片坏死,凋亡明显增加,心、肝、肾等重要器官未见明显异常。免疫组化结果显示：A组瘤体PCNA增殖指数LI显着降低,MVD值降至7.78±0.96。TUNEL染色结果显示：A组肿瘤细胞凋亡明显增多,AI值达40.41%±3.24%,差异具有统计学意义（P<0.01）。流式细胞学检测示A组G1/S期细胞比例明显高于其它组,而G2/M期细胞比例却低于其它组,说明联合治疗能很好的抑制肿瘤细胞DNA的复制,使更多的肿瘤细胞处于分裂前期结论phTERT-PE38KDEL与硼替佐米对裸鼠胰腺癌移植瘤均有抑制作用,二者联用效果更佳,该联合方案对正常组织器官无明显损害,具有较好的安全性和靶向性。

蔡艳玲^[7]（2011）在《RNAi靶向人端粒酶逆转录酶基因治疗大肠癌的实验研究》文中提出目的构建含有小发夹RNA （shRNA）的针对hTERT基因的重组真核质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA,并探讨RNA干扰人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）的表达对大肠癌SW480细胞凋亡的影响。方法设计合成3条针对hTERT基因的siRNA,将筛选出最有效的siRNA合成shRNA寡核苷酸片段插入到真核质粒pGPU6/GFP/Neo中,进行酶切和测序鉴定。将构建好的重组真核质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA,采用脂质体法转染人大肠癌SW480细胞。在荧光显微镜下观察细胞转染效率及细胞形态学变化。RT-PCR法检测不同转染时间SW480细胞中hTERTmRNA的表达水平。TRAP-PCR-ELISA法检测转染48小时后SW480细胞的端粒酶活性。免疫组化法检测SW480细胞中hTERT蛋白的表达。流式细胞仪检测转染后细胞周期分布。TUNEL法检测转染后细胞凋亡状况。激光共聚焦显微镜观察细胞线粒体跨膜电位（MMP）的变化。透射电镜观察转染后细胞超微结构。结果将筛选出干扰效率较好的的siRNA序列合成shRNA片段后,将其成功插入质粒pGPU6/GFP/Neo中,构成重组真核质粒pGPU6/GFP/ Neo-hTERT-shRNA。SW480细胞以质粒与脂质体比例为1：2.5、转染48h时的转染效率较高,其转染率达59%。RT-PCR结果显示,hTERT-shRNA组的hTERTmRNA表达水平在转染48h时降低较明显,与空白组、脂质体组、NC-shRNA组比较,抑制率分别是39.20%,33.28%,27.95%。TRAP-PCR-ELISA结果示,hTERT-shRNA组SW480细胞端粒酶活性显着降低18.7%,与其它三组比较,差别均有统计学意义（P<0.05）。免疫组化结果示,hTERT-shRNA组被染色的阳性细胞明显少于其他组,经病理图像分析软件分析灰度值后得出,转染48h后hTERT-shRNA组与空白组比较,差异有明显统计学意义（P<0.05）,同时与脂质体组和NC-shRNA组比较,差异均有统计学意义（P<0.01）。流式细胞仪结果示,hTERT-shRNA组G0/G1期细胞显着增加,S期细胞减少,提示hTERT-shRNA质粒转染SW480细胞后,使进入静止状态的细胞增多,细胞增殖指数下降约14.2%,与NC-shRNA组比较,差别有显着统计学意义（P<0.05）。TUNEL结果示,与其他组比较,hTERT-shRNA组凋亡细胞数显着增多,凋亡指数为21.5%,明显比其他组增高,差异有统计学意义（P<0.01）。激光共聚焦显微镜观察结果,hTERT-shRNA组可见多个含有核分裂相的细胞,细胞Rh123荧光强度明显增强,MMP显着下降,与其他组比较,差异有统计学意义（P<0.01）。透射电镜观察结果示,SW480细胞体积明显缩小,表面突起及微绒毛减少,甚至消失,细胞核固缩,染色质不均匀地沿核膜下聚集,空泡增多。结论成功构建了针对hTERT基因的重组真核表达质粒pGPU6/GF P/Neo-hTERT-shRNA。它能有效沉默hTERT基因,因而能有效抑制人大肠癌SW480细胞增殖生长,降低端粒酶活性,最终促使肿瘤细胞凋亡。目的研究靶向hTERT基因的重组质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA对人大肠癌SW480细胞裸鼠移植瘤的治疗作用。方法于裸鼠右侧腋下皮下注射人大肠癌SW480细胞建立大肠癌移植瘤动物模型,待肿瘤长到一定大小时,随机分为生理盐水组（NS组）、NC-shRNA组和hTERT-shRNA组。各组连续进行相应治疗6次后,观察肿瘤的生长状况,测量肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,HE染色观察肿瘤组织细胞形态学变化,免疫组化法检测移植瘤组织中hTERT蛋白的表达,TUNEL法检测肿瘤组织中细胞凋亡情况,RT-PCR法检测瘤组织中hTERTmRNA的表达,PCR-TRAP-ELISA法检测肿瘤组织的端粒酶活性。结果所有裸鼠在接种SW480细胞第14天后,皮下肿瘤结节直径达5-7mm,成功构建了裸鼠移植瘤模型,成瘤率为100%。荷瘤裸鼠开始治疗后,hTERT-shRNA组瘤体积增长速度慢于NS组和NC-ShRNA组,并于第18天开始明显减慢。HE染结果示,hTERT-shRNA组肿瘤组织出现局部坏死区,瘤组织细胞形态发生明显改变。免疫组化法检测结果示,hTERT-shRNA组肿瘤组织中hTERT蛋白表达水平下降,可见少量hTERT蛋白阳性细胞,细胞呈浅棕色。TUNEL法检测结果示,hTERT-shRNA组凋亡细胞数明显增多,细胞分布密集,与NS组和NC-shRNA组比较,凋亡指数分别增加29.4%和31.1%,差异有显着统计学意义（P<0.01）；RT-PCR法检测结果示,hTERT-shRNA组hTERT mRNA表达水平较NS组和NC-shRNA组分别下降52.1%和48.3%,差异具有显着性意义（P<0.01）。PCR-TRAP-ELISA法检测结果示,hTERT-shRNA组与NS组和NC-shRNA组比较,端粒酶活性降低较明显,抑制率分别为48.5%和53.0%,差异有统计学意义（P<0.05）。结论重组质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA通过下调hTERTmRNA和hTERT蛋白的表达,促进肿瘤细胞的凋亡,从而抑制大肠癌移植瘤的生长。

刘军楼,汪悦,徐力,杨继兵,于希忠,刘佳,唐宇宏^[8]（2010）在《冬凌草甲素对SW1990细胞的增殖抑制作用》文中研究说明背景与目的:中医药治疗肿瘤不良反应较小且疗效尚佳,在胰腺癌防治方面有较大的潜力与优势,正日益受到国内外医学界的关注。本研究观察中草药冬凌草甲素对人胰腺癌SW1990细胞的增殖抑制作用,并探讨其可能机制。方法:以不同浓度（12.5、25和50μmol/L）的冬凌草甲素作用于体外培养的SW1990细胞,采用MTT法检测细胞生长抑制率,光学显微镜下观察药物对细胞形态的影响。DAPI法染色后,用荧光显微镜观察细胞核凋亡,用流式细胞仪检测细胞凋亡率,实时荧光定量PCR检测细胞凋亡前后端粒酶hTERT mRNA表达水平的变化。结果:冬凌草甲素对人胰腺癌SW1990细胞具有明显的增殖抑制作用,荧光显微镜见到典型的细胞凋亡形态学改变。冬凌草甲素12.5、25和50μmol/L给药组早期细胞凋亡的百分率显着高于未给药组[（2.17±0.57）%、（5.83±0.57）%、（4.43±0.78）%vs（0.30±0.17）%,P<0.05],晚期细胞凋亡和坏死细胞的百分率也显着高于未给药组[（5.10±0.98）%、（7.03±1.52）%、（10.13±0.70）%vs（2.63±0.06）%,P<0.05]。冬凌草甲素12.5、25和50μmol/L给药组端粒酶hTERT mRNA的表达水平显着高于未给药组（7.72±0.33、8.17±0.67、10.36±1.65 vs 5.94±0.17,P<0.05）。结论:冬凌草甲素可抑制胰腺癌SW1990细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡,其作用机制可能与药物引起端粒酶hTERT mRNA的表达水平均降低有关。

欧阳华强^[9]（2009）在《清胰化积方对人胰腺癌CFPAC-1裸鼠移植瘤的抑瘤作用及其机理研究》文中进行了进一步梳理目的了解清胰化积方对人胰腺癌CFPAC-1裸鼠移植瘤的抑瘤作用,从细胞因子、细胞周期、癌相关基因表达层面探索其抑瘤机理。方法1.清胰化积方对人胰腺癌CFPAC-1裸鼠移植瘤的抑瘤作用研究采用荷CFPAC-1人胰腺癌裸小鼠模型,随机分组后,以不同剂量的清胰化积方及化疗药物进行干预,观察药物的体内抑瘤作用。2.清胰化积中药对人胰腺癌CFPAC-1裸鼠移植瘤的抑瘤机理探讨2.1采用ELISA法检测裸鼠血清细胞因子VEGF、TNF-α、sVCAM-1、TGF-β1、IL-6和IL-8的表达;2.2用流式细胞术检测清胰化积方对CFPAC-1裸鼠移植瘤细胞周期的影响;2.3用普通RT-PCR及qPCR法检测EphB2的表达,并针对目标基因EphB2构建慢病毒干扰载体,进行RNA干扰等深入研究。结果1.清胰化积方对人胰腺癌CFPAC-1裸鼠移植瘤的抑瘤作用研究清胰化积方对人胰腺癌CFPAC-1细胞株体内生长有一定的抑制作用,中药组瘤重低于对照组（p＜0.05）,清胰化积方各剂量组的抑瘤率约32～34%。2.清胰化积中药对人胰腺癌CFPAC-1裸鼠移植瘤的抑瘤机理探讨2.1清胰化积方对人胰腺癌CFPAC-1裸鼠血清VEGF、TNF-α、sVCAM-1、TGF-β1、IL-6和IL-8表达水平的影响:清胰化积方治疗后相应组裸鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8水平显着低于对照组（p＜0.05）,且与瘤重呈正相关。各组裸鼠血清VEGF、TGF-β1、和sVCAM-1表达水平之间无显着性差异（P＞0.05）。2.2清胰化积方对人胰腺癌CFPAC-1裸鼠移植瘤细胞周期的影响:清胰化积方治疗后CFPAC-1细胞出现S期阻滞,S期细胞比例明显高于对照组,G2/M期细胞比例低于对照组（P＜0.01）。各组间的凋亡率则无显着性差异（P＞0.05）。2.3清胰化积方对人胰腺癌CFPAC-1裸鼠移植瘤EphB2表达的影响:清胰化积方组EphB2表达水平与对照组相比较有两倍以上的上调。针对CFPAC-1细胞系进行EphB2 RNA干扰后,流式细胞分析提示EphB2下调可以抑制CFPAC-1细胞的凋亡。结论1.清胰化积方对人胰腺癌CFPAC-1体内生长有明显的抑制作用,主要表现为诱导胰腺癌细胞发生坏死。2.清胰化积方抑瘤作用的机理,可能与减少人胰腺癌CFPAC-1荷瘤裸鼠血清细胞因子含量、诱导肿瘤细胞周期的S期阻滞及上调EphB2基因表达有关。

周家华^[10]（2008）在《hTERT和Amy-2启动子联合调控ePNP/MePdR自杀基因系统靶向治疗胰腺癌的实验研究》文中认为背景:人胰腺癌是临床常见肿瘤之一,发病率呈上升趋势,手术可切除率在10%左右,以手术为主的综合治疗手段效果不好,术后转移早,其中位生存时间不足6个月,五年生存率小于5%;而在90%不可切除的病例中,化疗和放疗副反应大。因此,提高治疗效果,探索胰腺癌的基因治疗有重要意义。然而基因治疗的疗效并不令人满意,原因是多方面的,其中转移基因在靶细胞组织或器官中表达的时空特异性、基因治疗载体的安全性等问题严重影响了此项工作的进展。目的:以自杀基因大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶基因ePNP为调控的靶点,以人胰腺淀粉酶基因-2A（Amy-2）为胰腺组织特异性启动子和端粒酶亚单位hTERT为肿瘤靶向性启动子,构建载体phTPNPamyCre,使胰腺组织特异性启动子pAmy-2及肿瘤靶向性启动子phTERT先后顺序发挥调控,使ePNP在胰腺癌细胞特异性表达,而对其他组织和胰腺正常组织不发挥作用。方法:运用荧光素酶报告载体分别构建端粒酶亚单位hTERT为肿瘤靶向性启动子phTERT和胰腺组织特异性启动子pAmy-2质粒并检测其活性,利用分子生物学技术,结合PBS302和PBS185载体构建载体phTPNPamyCre;运用基因转染方法将phTPNPamyCre转染人胰腺癌细胞株Capan-1、SW1990、Panc-1、BxPC-3和MIAPaCa-2,建立BxPC-3·PNP的稳定细胞系,通过PCR、Westernblot、MTT实验等方法观察phTPNPamyCre/MePdR自杀基因系统对人胰腺癌细胞靶向治疗作用。结果:1.构建成功phTERT-luc和pAmy2-luc载体,证明了hTERT和Amy-2的启动子在相应细胞内的转录活性;利用原核表达系统表达了ePNP蛋白,并利用该蛋白免疫小鼠,制备得到鼠抗ePNP蛋白的多克隆抗体;2.在肿瘤细胞中,hTERT启动子能较好的驱动ePNP基因表达及在胰腺细胞中Amy-2启动子能较好的驱动Cre重组酶蛋白的表达;3.构建成功的双启动子调控ePNP的载体phTPNPamyCre有很好的胰腺组织特异性和肿瘤靶向性,在胰腺肿瘤细胞中能很好的表达ePNP蛋白;4.phTPNPamyCre转染胰腺癌细胞后,对MePdR有较好的敏感性,且呈剂量依赖性,并有一定的“旁观者”效应。结论:phTPNPamyCre/MePdR自杀基因治疗系统对人胰腺癌细胞有很好的靶向治疗作用

二、人胰腺癌与端粒酶及其亚单位表达的关系（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、人胰腺癌与端粒酶及其亚单位表达的关系（论文提纲范文）

（1）KLF2对胰腺癌细胞的生物学行为影响和机制研究（论文提纲范文）

（2）胰腺癌组织端粒酶逆转录酶的表达与临床病理的关系研究（论文提纲范文）

（4）MUC1、DPC4基因及端粒酶基因在胰腺癌中的表达及临床意义（论文提纲范文）

（5）一种新的hTERT相互作用蛋白的筛选及鉴定（论文提纲范文）

（6）靶向phTERT-PE38KDEL重组质粒联合硼替佐米抑制裸鼠胰腺癌移植瘤生长的研究（论文提纲范文）

（7）RNAi靶向人端粒酶逆转录酶基因治疗大肠癌的实验研究（论文提纲范文）

（8）冬凌草甲素对SW1990细胞的增殖抑制作用（论文提纲范文）

（9）清胰化积方对人胰腺癌CFPAC-1裸鼠移植瘤的抑瘤作用及其机理研究（论文提纲范文）

（10）hTERT和Amy-2启动子联合调控ePNP/MePdR自杀基因系统靶向治疗胰腺癌的实验研究（论文提纲范文）

四、人胰腺癌与端粒酶及其亚单位表达的关系（论文参考文献）

• [1]KLF2对胰腺癌细胞的生物学行为影响和机制研究[D]. 戴月娣. 苏州大学, 2020(06)
• [2]胰腺癌组织端粒酶逆转录酶的表达与临床病理的关系研究[J]. 薛福龙. 中国医药指南, 2014(11)
• [3]冬凌草的化学和药理作用研究[J]. 高世勇,王珑. 哈尔滨商业大学学报(自然科学版), 2014(01)
• [4]MUC1、DPC4基因及端粒酶基因在胰腺癌中的表达及临床意义[D]. 孙大伟. 青岛大学, 2013(S1)
• [5]一种新的hTERT相互作用蛋白的筛选及鉴定[D]. 周丽娜. 第三军医大学, 2013(11)
• [6]靶向phTERT-PE38KDEL重组质粒联合硼替佐米抑制裸鼠胰腺癌移植瘤生长的研究[D]. 邢帅. 天津医科大学, 2012(03)
• [7]RNAi靶向人端粒酶逆转录酶基因治疗大肠癌的实验研究[D]. 蔡艳玲. 广西医科大学, 2011(09)
• [8]冬凌草甲素对SW1990细胞的增殖抑制作用[J]. 刘军楼,汪悦,徐力,杨继兵,于希忠,刘佳,唐宇宏. 中国癌症杂志, 2010(12)
• [9]清胰化积方对人胰腺癌CFPAC-1裸鼠移植瘤的抑瘤作用及其机理研究[D]. 欧阳华强. 复旦大学, 2009(05)
• [10]hTERT和Amy-2启动子联合调控ePNP/MePdR自杀基因系统靶向治疗胰腺癌的实验研究[D]. 周家华. 南京医科大学, 2008(12)

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