一、NF-κB抑制剂对烫伤脓毒症大鼠致炎/抗炎细胞因子表达的影响（论文文献综述）
宣鹏飞[1]（2021）在《调控HCAR1介导的免疫反应对MSCs移植治疗脓毒症的作用研究》文中认为目的:通过外周血炎症细胞因子及HCAR1、MHCⅡ相关信号传导通路的改变,来了解调控HCAR1介导的以MHCⅡ下调为主的免疫反应对脂肪间充质干细胞（ADSCs）移植治疗脓毒症的作用,为治疗脓毒症提供新思路。方法:1.临床实验:研究对象为脓毒症组（Sepsis组）及健康对照组（NS组）各20例,Sepsis组于入院第1天、NS组于体检当时留取外周血,荧光定量RT-PCR法检测脓毒症外周血有核细胞总RNA中HCAR1、MHCⅡ、TLR4和NLRP3 m RNA的表达;酶联免疫吸附试验法（ELISA）法检测脓毒症外周血清细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-10及IL-18的表达。2.动物实验:首先体外培养大鼠脂肪间充质干细胞（ADSCs）,使用CD90、CD44、CD35和CD45对大鼠脂肪间充质干细胞进行免疫荧光鉴定,之后使用含有GFP荧光蛋白基因的慢病毒转染细胞,使细胞被GFP荧光标记备用;随机选用SD雄性大鼠分为5组,（1）正常对照组（NC组）（2）脓毒症模型组（LPS组）（3）脂肪间充质干细胞移植组（L+M组）（4）合并HCAR1受体激动剂组（L+Gi+M组）（5）合并HCAR1受体抑制剂组（L+Gk+M组）,每组各6只。脓毒症模型建立:以5mg/kg剂量向（2）（3）（4）（5）组大鼠腹腔注射LPS,建立脓毒模型;30min以后向（3）组大鼠尾静脉注射200ul（1x106cell/ml）ADSCs;向（4）（5）组大鼠按30mg/kg剂量腹腔注射HCAR1受体激动剂和抑制剂,观察1小时后,再向（4）（5）组大鼠尾静脉注射200ul（1x106cell/ml）ADSCs;于模型建立第3天,10%苯巴比妥浅麻醉后活体成像荧光示踪;然后对各组剩余大鼠麻醉解剖,留取肺组织首先行快速冰冻切片,HE染色观察各组显微镜下病理改变,激光共聚焦成像观察细胞荧光定位情况,随后使用酶联免疫吸附ELISA法检测外周血炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-10及IL-18的表达量;荧光定量RT-PCR法检测HCAR1、MHCⅡ、TLR4和NLRP3mRNA的表达;蛋白免疫印迹法Western blot法检测HCAR1、MHCⅡ、TLR4和NLRP3蛋白的表达情况。结果:1、临床实验:通过对健康体检者和脓毒症患者血液样本进行检测RT-PCR法验证基因差异性表达发现Sepsis组各患者外周血HCAR1mRNA的表达量（7.06±2.18）较NS组表达量（10.7±3.13）均显着下降（t=4.24,P<0.05）,而Sepsis组中MHCⅡ、TLR4和NLRP3等m RNA的表达量[分别为（9.19±1.90）、（11.7±2.69）及（5.98±1.58）]较NS组表达量[分别为（7.40±1.97）、（8.33±1.95）及（3.60±0.937）]均显着增高（t分别为2.91、4.49及5.81,P<0.05）。ELISA法验证血清中IL-1β、TNF-α、IL-10及IL-18等细胞因子的差异性表达发现Sepsis组各患者外周血中IL-1β、IL-18、TNF-α及IL-10细胞因子的表达量[分别为（71.7±7.16）、（97.7±8.16）、（94.7±16.0）及（25.4±4.73）pg/ml]较NS组表达量[分别为（64.8±6.47）、（84.9±9.51）、（73.4±4.15）及（21.2±5.05）pg/ml]均显着升高（t分别为3.19、4.56、5.79及2.72,P<0.05）。绘制受试者工作特征曲线（ROC曲线）分析发现在HCAR1、TLR4、MHCⅡ及NLRP3 m RNA表达中外周血HCAR1、TLR4、MHCⅡ及NLRP3的ROC曲线下面积（AUC）分别为:0.830、0.853、0.735及0.945,基因检测方面NLRP3的诊断价值最优;而外周血清IL-1β、IL-18、TNF-α及IL-10的ROC曲线下面积（AUC）分别为:0.751、0.841、0.924及0.729,细胞因子检测方面TNF-α的诊断价值最优。进一步相关性分析发现信号调节关键分子HCAR1与TLR4、MHCⅡ及NLRP3 m RNA表达呈负相关（r值分别为:-0.666、-0.587及-0.621,P<0.05）;而炎症反应信号通路TLR4与下游NLRP3及IL-1β、IL-18、TNF-α等炎症因子表达呈正相关（r值分别为:0.641、0.666、0.624及0.606,P<0.05）。2、动物实验:我们成功培养了大鼠脂肪间充质干细胞,并用GFP荧光蛋白稳定标记细胞备用。同时我们成功构建了脓毒症、干细胞移植、干细胞移植合并HCAR1受体激动剂和抑制剂等各组别动物模型。首先观察大鼠脂肪间充质干细胞GFP慢病毒标记活体荧光示踪,证明ADSCs移植后可经血液循环定植于肺脏;然后对各组大鼠肺组织行冰冻切片后行激光共聚焦荧光成像,以GFP荧光量粗观测ADSCs移植后肺内定植数目,发现LPS组与NC组无脂肪间充质干细胞移植;L+M组与LPS组对比显示肺组织内有绿色荧光标记的间充质干细胞分布;L+Gi+M组与L+M组对比显示肺组织内绿色荧光标记的间充质干细胞数目增多;L+Gk+M组与L+Gi+M组及L+M组对比肺组织内荧光标记干细胞数目和分布明显下降,各组之间存在差异;后对各组大鼠肺组织内GFP蛋白行Western blot实验检测发现:NC组及LPS组确无GFP蛋白表达,其余各组均可检测到GFP蛋白差异性表达,L+Gi+M组（0.849±0.148）较L+M组（0.582±0.124）呈明显高水平表达（t=3.38,P<0.05）;L+Gk+M组（0.332±0.0747）较L+Gi+M组及L+M组均呈低水平表达（t=7.64及4.24,P<0.05）。后对各组大鼠肺组织行切片HE染色发现LPS组与NC组对比显示出现弥漫性的肺泡损伤改变;L+M组与LPS组对比显示充血水肿有所减轻,肺泡腔及肺间质结构局部完整可见;L+Gi+M组与L+M组及LPS组对比显示炎症细胞浸润明显减少,未见明显充血水肿,肺泡及肺间质等结构清晰;L+Gk+M组与L+Gi+M组及L+M组对比显示炎症细胞浸润明显增多,可见充血水肿,肺泡及肺间质等结构部分清晰,但较LPS组病理损伤程度弱。通过对各组模型大鼠血液样本进行RT-PCR法验证基因差异性表达发现HCAR1受体m RNA相对表达量比较:LPS组（3.09±0.977）较NC组（6.09±0.539）表达明显降低（t=6.60,P<0.05）;L+M组（9.66±1.40）与LPS组相比表达明显增高（t=9.45,P<0.05）;L+Gi+M组（14.3±2.07）较L+M组及NC组均呈高水平表达（t=4.58及9.43,P<0.05）;L+Gk+M组（8.39±1.48）较L+Gi+M组表达呈明显降低,但仍高于LPS组（t=5.73及7.33,P<0.05）,较L+M组表达有所下降,但差异无明显统计学意义（t=1.53,P>0.05）。TLR4、MHCⅡ及NLRP3 m RNA相对表达量比较:LPS组[（24.8±3.18）、（17.4±2.23）及（15.0±1.93）]较NC组[（6.26±0.544）、（4.34±0.383）及（3.91±0.346）]表达显着增高[检验值分别为（t=14.1、14.1及13.9,P<0.05）];L+M组[（17.1±1.53）、（11.5±1.03）及（9.56±0.854）]较LPS组表达有所下降[检验值分别为（t=5.32、5.85及t=6.36,P<0.05）];L+Gi+M组[（12.3±1.78）、（9.52±1.38）及（7.37±1.07）]较L+M组呈明显低水平表达,但仍高于NC组表达[检验值分别为（t=5.02及7.95,P<0.05）、（t=2.85及8.89,P<0.05）及（t=3.93及7.57,P<0.05）];L+Gk+M组[（20.1±2.15）、（13.5±1.44）及（11.7±1.25）]较L+Gi+M组表达呈明显增高,但仍低于LPS组表达[检验值分别为（t=6.88及2.96,P<0.05）、（t=4.86及3.62,P<0.05）及（t=6.50及3.53,P<0.05）],同时较L+M组仍呈高水平表达[检验值分别为（t=2.81、2.70及3.51,P<0.05）]。进一步对各组模型大鼠肺组织样本行RT-PCR法验证基因差异性表达,发现HCAR1受体m RNA相对表达量比较:LPS组（3.02±0.770）较NC组（5.65±0.499）表达明显降低（t=7.00,P<0.05）;L+M组（8.96±1.08）与LPS组相比明显增高（t=11.0,P<0.05）;L+Gi+M组（13.8±2.00）较L+M组及NC组均呈高水平表达（t=5.27及9.74,P<0.05）;L+Gk+M组（7.83±1.38）较L+Gi+M组表达呈明显降低,但仍高于LPS组（t=6.07及7.45,P<0.05）,同时较L+M组表达有所下降,差异无统计学意义（t=1.59,P>0.05）。TLR4、MHCⅡ及NLRP3 m RNA相对表达量比较:LPS组[（18.8±2.41）、（11.8±1.52）及（12.7±1.63）]较NC组[4.95±0.437)、（3.16±0.280）及（5.33±0.471）]表达明显增高[检验值分别为（t=13.8、13.8及10.6,P<0.05）];L+M组[（13.4±1.20）、（8.32±0.743）及（9.17±0.819）]较LPS组表达有所下降[检验值分别为（t=4.87、5.09及4.75,P<0.05）];L+Gi+M组[（9.20±1.33）、（6.62±0.957）及（6.65±0.585）]较L+M组呈明显低水平表达,但仍高于NC组表达[检验值分别为（t=5.78及7.44,P<0.05）、（t=3.44及8.50,P<0.05）及（t=6.14及4.30,P<0.05）];L+Gk+M组[（15.7±1.67）、（10.0±1.07）及（10.8±1.15）]较L+Gi+M组表达呈明显增高,但仍低于LPS组表达[检验值分别为（t=7.44及2.57,P<0.05）、（t=5.83及2.37,P<0.05）及（t=7.90及2.32,P<0.05）],同时较L+M组仍呈高水平表达[检验值分别为（t=2.70、3.23及2.85,P<0.05）]。后对各组模型大鼠肺组织样本行Western blot法验证蛋白差异性表达发现HCAR1受体蛋白相对表达量比较:LPS组（0.187±0.0460）较NC组（0.541±0.127）表达明显降低（t=6.44,P<0.05）;L+M组（1.00±0.225）与LPS组相比明显增高（t=8.67,P<0.05）;L+Gi+M组（1.34±0.289）较L+M组及NC组均呈高水平表达（t=2.30及6.22,P<0.05）;L+Gk+M组（0.854±0.197）较L+Gi+M组表达呈明显降低,但仍高于LPS组（t=3.43及8.10,P<0.05）,同时较L+M组表达有所下降,但差异未见明显统计学意义（t=1.19,P>0.05）。TLR4、MHCⅡ及NLRP3蛋白相对表达量比较:LPS组[（1.17±0.234）、（1.38±0.307）及（1.26±0.243）]较NC组[（0.258±0.0576）、（0.293±0.0513）及（0.201±0.0344）]表达明显增高[检验值分别为（t=9.31、8.54及10.6,P<0.05）];L+M组[（0.683±0.0957）、（0.811±0.198）及（0.760±0.174）]较LPS组表达有所下降[检验值分别为（t=4.76、3.81及4.09,P<0.05）];L+Gi+M组[（0.437±0.0933）、（0.573±0.145）及（0.410±0.0788）]较L+M组呈明显低水平表达,但仍高于NC组表达[检验值分别为（t=4.50及4.01,P<0.05）、（t=2.38、及4.47,P<0.05）及（t=4.48及5.96,P<0.05）];L+Gk+M组[（0.860±0.115）、（1.05±0.127）及（0.982±0.167）]较L+Gi+M组表达呈明显增高,但仍低于LPS组表达[检验值分别为（t=7.00及2.95,P<0.05）、（t=6.06及2.44,P<0.05）及（t=7.59及2.30,P<0.05）],同时较L+M组仍呈高水平表达[检验值分别为（t=2.91、2.47及2.26,P<0.05）]。我们进一步使用ELISA法检测细胞因子发现IL-1β、IL-18及TNF-α细胞因子表达量比较:LPS组[（30.2±2.44）、（83.9±6.28）及（140±12.6）pg/ml]较NC组[（6.81±0.585）、（34.3±2.09）及（21.7±3.15）pg/ml]表达显着增高[检验值分别为（t=22.9、18.4及22.3,P<0.05）];L+M组[（21.0±1.75）、（63.5±5.58）及（91.3±11.6）pg/ml]较LPS组明显降低[检验值分别为（t=7.54、5.95及7.01,P<0.05）];L+Gi+M组[（12.6±1.64）、（41.8±5.73）及（67.6±13.8）pg/ml]较L+M组呈低水平表达,仍较NC组呈高水平表达[检验值分别为（t=8.58及8.14,P<0.05）、（t=6.63及3.03,P<0.05）及（t=3.21及7.96,P<0.05）];L+Gk+M组[（24.5±1.57）、（71.9±4.72）及（111±9.66）pg/ml]较L+Gi+M组、L+M组表达呈明显增高,但低于LPS组表达[检验值分别为（t=12.8、3.58及4.89,P<0.05）、（t=9.94、2.84及3.72,P<0.05）及（t=6.24、3.12及4.61,P<0.05）]。IL-10细胞因子表达量比较:LPS组（10.4±1.44）pg/ml较NC组（5.76±1.55）pg/ml表达明显增高（t=5.41,P<0.05）;L+M组（15.5±1.28）pg/ml较LPS组明显升高（t=6.39,P<0.05）;L+Gi+M组（23.7±2.83）pg/ml较L+M组及NC组均呈高水平表达（t=6.48及13.6,P<0.05）;L+Gk+M组（13.1±0.493）pg/ml较L+Gi+M组、L+M组表达呈明显下降,但仍高于LPS组表达（t=8.97、4.13及4.38,P<0.05）。对大鼠外周血m RNA相关因子行相关性分析发现LPS组、L+M组、L+Gi+M组及L+Gk+M组中HCAR1的表达与TLR4（r分别为:-0.840、-0.814、-0.854及-0.843）、MHCⅡ（r分别为:-0.813、-0.824、-0.875及-0.860）和NLRP3（r值分别为:-0.867、-0.837、-0.828及-0.862）的表达在m RNA水平均呈负相关（P均<0.05）。同时大鼠肺组织m RNA相关因子行相关性分析发现在上诉各组中HCAR1的表达与TLR4（r值分别为:-0.821、-0.853、-0.854及-0.862）、MHCⅡ（r值分别为:-0.872、-0.847、-0.814及-0.862）和NLRP3（r值分别为:-0.831、-0.915、-0.925及-0.859）的表达在m RNA水平也均呈负相关（P均<0.05）。而对大鼠肺组织蛋白相关因子相关性分析发现HCAR1的表达与TLR4（r值分别为:-0.876、-0.830、-0.861及-0.901）、MHCⅡ（r值分别为:-0.815、-0.899、-0.922及-0.845）和NLRP3（r值分别为:-0.884、-0.848、-0.893及-0.872）的表达在蛋白水平依旧呈明显负相关（P均<0.05）。结论:临床水平:1、脓毒症状态下细胞因子IL-1β、IL-18、IL-10、TNF-α的表达明显增高;外周血MHCII、TLR4和NLRP3基因及表达明显增高,且TLR4与NLRP3、IL-1β、IL-18、TNF-α等细胞因子表达呈明显正相关;而HCAR1基因表达明显减少,且HCAR1与MHCⅡ、TLR4和NLRP3呈明显负相关,表明脓毒症状态下TLR4/NLRP3炎症反应信号通路激活释放大量炎症因子,伴随着HCAR1表达下调,MHCⅡ作用增强加剧炎症反应。2、通过ROC曲线下面积分析发现基因检测NLRP3和ELISA检测TNF-α细胞因子表达可成为脓毒症优选诊断标志。动物水平:1、脂肪间充质干细胞（ADSCs）移植可以部分减少MHCⅡ、TLR4和NLRP3以及IL-1β、IL-18、TNF-α的表达,上调HCAR1和抗炎因子IL-10的表达;且HCAR1与MHCⅡ、TLR4和NLRP3呈明显负相关,表明脂肪间充质干细胞可能通过抑制TLR4信号通路减弱,一方面直接抑制炎症反应,另一方面减弱对HCAR1表达的抑制,调节了MHCⅡ介导的异体排斥作用,增加干细胞移植率,更好的发挥抗炎作用。2、使用HCAR1激动剂后ADSCs移植较单独ADSCs移植可以明显抑制MHCⅡ、TLR4和NLRP3以及IL-1β、IL-18、TNF-α的表达,而HCAR1和抗炎因子IL-10的表达明显增高,且HCAR1与MHCⅡ、TLR4和NLRP3仍呈明显负相关,说明HCAR1表达增加或作用增强可能通过进一步下调MHCⅡ介导的异体排斥作用,明显增加干细胞移植率及抑炎治疗效果。但使用HCAR1受体抑制剂处理后进行ADSCs移植可以明显抑制受体功能并逆转上述抑炎效应,说明调节HCAR1受体表达对间充质干细胞移植治疗脓毒症有增效作用。
廖梦玲[2]（2021）在《基于PI3K-Ⅰ和PI3K-Ⅲ的动态变化规律研究青蒿琥酯抗炎作用的分子机制》文中研究指明目的:研究LPS对小鼠巨噬细胞中PI3K-Ⅰ、PI3K-Ⅲ及其介导的信号转导通路中关键分子mRNA、蛋白磷酸化影响的动态变化规律以及青蒿琥酯（artesunate,AS）的干预作用。方法:一、青蒿琥酯对LPS诱导前炎症细胞因子释放的影响1.LPS（100 ng/m L）处理小鼠巨噬细胞2、4、8 h建立模型,确定LPS处理的时间,ELISA法检测上清液中前炎症细胞因子TNF-α含量;2.自噬抑制剂3-MA（0.60 mg/m L）预孵2 h,LPS（100 ng/m L）处理小鼠巨噬细胞4 h后,ELISA法检测上清液中TNF-α含量;3.不同浓度的AS（10、20、30μg/m L）预孵2 h,随后LPS（100 ng/m L）处理RAW264.7细胞4 h后,ELISA法检测细胞上清液中TNF-α含量;4.AS（20μg/m L）预孵小鼠腹腔巨噬细胞（Mouse peritoneal macrophages,PMs）2h,LPS（100 ng/m L）处理PMs 4 h后,ELISA法检测上清液中TNF-α、IL-6水平;5.分别加入3-MA（0.60 mg/m L）和AS（20μg/m L）预孵2 h,随后LPS（100 ng/m L）处理RAW264.7细胞4 h后,ELISA法检测上清液中TNF-α含量;二、LPS对PI3K-Ⅰ、PI3K-Ⅲ及其介导的相关信号通路上关键分子mRNA表达的影响LPS（100 ng/m L）处理PMs不同时间（0、.5、1、2、3、4、8、12、24 h）后收取细胞沉淀,实时定量聚合酶链反应检测PI3K-Ⅲ、TLR4、Myd88、TRAF6、Beclin1、NF-κB p65、NF-κB p50、ATG16L1、p62、TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ、PI3K-Ⅰ、AKT、m TOR mRNA的动态变化情况;三、LPS对PI3K-Ⅰ、PI3K-Ⅲ磷酸化水平的影响及青蒿琥酯的干预作用1.LPS（100 ng/m L）处理PMs不同时间（0、0.25、0.5、1、2、4、8、12 h）后收取细胞沉淀,免疫印迹法检测PI3K-Ⅰ、PI3K-Ⅲ磷酸化水平的动态变化情况;2.AS（20μg/m L）预孵2 h,LPS（100 ng/m L）处理PMs 0.5 h后收集细胞沉淀,免疫印迹法检测PI3K-Ⅲ（Ser249）磷酸化水平的变化。结果:一、青蒿琥酯对LPS诱导前炎症细胞因子释放的抑制作用1.LPS（100 ng/m L）能够诱导小鼠巨噬细胞大量释放TNF-α;2.自噬抑制剂3-MA（0.60 mg/m L）能够显着抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞TNF-α的释放;3.AS（20μg/m L）能够显着抑制LPS诱导PMs释放TNF-α、IL-6;4.无论是单独给予3-MA、AS,还是联合给予3-MA和AS,都能显着抑制LPS诱导的RAW264.7细胞释放TNF-α;二、LPS对PI3K-Ⅰ、PI3K-Ⅲ及其介导的相关信号通路上关键分子mRNA表达的影响LPS能够显着上调TLR4/My D88/TRAF6/Beclin1/PI3K-Ⅲ信号通路分子mRNA表达,显着下调PI3K-Ⅰ/AKT/m TOR信号通路分子mRNA表达;三、LPS对PI3K-Ⅰ、PI3K-Ⅲ磷酸化水平的影响及青蒿琥酯的干预作用1.LPS能够显着升高细胞PI3K-Ⅲ（Ser249）和PI3K-Ⅰ磷酸化水平;2.LPS能够显着升高细胞PI3K-Ⅲ（Ser249）的磷酸化水平,而AS能够显着抑制其升高。结论:LPS能够诱导PI3K-Ⅲ及其介导的信号通路关键分子mRNA表达显着升高、PI3K-Ⅰ及其介导的信号通路关键分子mRNA表达显着降低以及PI3K-Ⅲ（Ser249）和PI3K-Ⅰ磷酸化水平显着升高,以上信号通路与LPS诱导PMs释放大量前炎症细胞因子密切相关;AS具有显着的抗炎作用,其发挥抗炎作用的分子机制与抑制PI3K-Ⅲ（Ser249）磷酸化水平密切相关。
尚圣兰[3]（2020）在《青蒿琥酯对脓毒症免疫抑制模型小鼠保护作用的分子机制研究》文中进行了进一步梳理脓毒症（Sepsis）是因感染或感染因素而导致的宿主反应失调所引起的危及生命的器官功能障碍综合征,是临床创/烧伤和感染患者的常见并发症,是临床危重症患者死亡的主要原因。脓毒症的病理生理过程表现为过度的炎症反应/细胞因子风暴（cytokine storm）和免疫抑制（immunosuppression）两个阶段,二者可能同时存在,但在不同的发展阶段占据主要地位。脓毒症早期主要表现为细胞因子风暴引起的过度炎症反应,而后期主要为免疫细胞功能障碍引起的免疫抑制。目前认为,免疫抑制导致的二次感染及其多器官功能衰竭是脓毒症患者晚期死亡的主要原因,天然免疫系统和获得性免疫系统在其中均发挥重要作用。长期以来,脓毒症的研究主要聚焦于细胞因子风暴及其造成的多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）,但是迄今为止尚无有效而安全的针的药物问世。近年来来自临床的报告显示,虽然病人度过前期的细胞因子风暴阶段,但是许多病人却因后期的免疫抑制导致的感染和MODS而死亡,因此人们将研究焦点又转向脓毒症免疫抑制阶段。基于脓毒症的病理生理过程,我们认为,治疗脓毒症的理想药物应当是一种良好的免疫调节剂,能够不受治疗“时间窗”的限制,即在过度炎症（细胞因子风暴）阶段发挥抗炎作用,同时能够逆转免疫抑制阶段,发挥免疫增强剂的作用。我们课题组长期致力于脓毒症发病机制及治疗措施研究和青蒿琥酯（artesunate,AS）的药理作用及其机制研究。我们前期的研究发现AS具有良好的抗炎作用:对多种小鼠、大鼠脓毒症模型均具有良好的保护作用,显着降低动物血清的致炎因子TNF-α和IL-6水平、提高动物的存活率。在LPS耐受小鼠接受铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）二次打击的小鼠模型上中,我们发现在AS对模型小鼠具有显着的保护作用。因此,我们推测AS可能是一种具有双向免疫调节作用的免疫调节药。在本研究中,我们采用盲肠结扎穿孔术（cecal ligation and puncture,CLP）诱导的脓毒症免疫抑制小鼠模型、CLP二次打击小鼠模型,研究AS对CLP诱导的脓毒症免疫抑制小鼠的治疗作用。在免疫抑制小鼠模型中,检测小鼠血液、脾脏及肺脏中前炎症细胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的水平;结果显示,AS显着提高免疫抑制小鼠低水平的前炎症细胞因子水平。在CLP二次打击小鼠模型中,观察小鼠7天死亡率,检测小鼠血液、脾脏及肺脏中细菌负荷量以及其前炎症细胞因子的水平;结果显示,AS显着提高模型小鼠7天生存率,提高小鼠清除细菌的能力及前炎症细胞因子水平,表明AS对CLP诱导的脓毒症免疫抑制小鼠具有显着的保护作用。单核-吞噬细胞系统是机体抵抗病原微生物的第一道防线,在识别病原微生物、清除病原微生物以及抗原的处理、提呈中发挥重要作用,如果其功能受到抑制,则机体清除细菌能力降低。在脓毒症免疫抑制阶段,单核-吞噬细胞系统功能低下,因此恢复单核-吞噬细胞系统的正常功能对提高脓毒症患者的生存率具有重要意义。本研究采用LPS耐受单核/巨噬细胞模型,从前炎症细胞因子水平及清除细菌的能力等两方面研究AS的药理作用。在此基础上,进一步研究自噬激活剂和自噬抑制剂对LPS耐受状态的形成及AS作用的影响,并检测了AS对LPS耐受细胞自噬水平的影响;结果显示,AS对可提高LPS耐受细胞清除细菌的能力和前炎症细胞因子水平,自噬激活剂可影响LPS耐受状态的形成,自噬抑制剂可抑制AS的作用,说明LPS耐受状态的形成与细胞自噬功能降低密切相关,而AS的作用与提高细胞的自噬功能有关。为探索参与AS作用的可能靶点与相互作用分子,本研究通过中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP）预测了AS相互作用候选分子。采用逆转录-聚合酶链反应（quantitative real-time PCR,q PCR）法及蛋白免疫印迹法（Western Blot,WB）筛选出相互作用分子维生素D受体（vitamin D receptor,VDR）。通过改变Vdr（敲低和过表达）检测对LPS耐受状态及AS作用的影响,并在体外实验中采用相互作用检测方法再次确认二者的相互作用。结果显示,在LPS耐受细胞中Vdr m RNA及VDR蛋白的表达显着增加,而AS可显着降低其表达;改变Vdr的表达将影响LPS耐受状态的形成及AS的作用,说明VDR与LPS耐受状态的形成及AS作用密切相关。VDR属于类固醇激素/甲状腺激素受体超家族成员,作为核转录因子,VDR的靶基因约1千多个,涉及钙磷代谢以及免疫、炎症等众多基因。研究发现,自噬形成过程中的关键基因Atg16l1为VDR的靶基因,抗菌肽Cathelicidins是VDR的直接靶基因。VDR可以通过调控Atg16l1、Cathelicidins的转录和表达从而调控细胞的自噬过程,发挥对自噬和清除细菌过程的调控作用。作为核转录因子,活化的VDR可迅速转位至细胞核,然后调节靶基因的转录活性。此外,VDR也可与核转录因子NF-κB p65发生相互作用,抑制NF-κB p65的核转位,从而抑制NF-κB p65对下游炎症因子的调控。因此,本研究从VDR对其下游靶基因的调控及其与NF-κB p65的相互作用两个方面展开研究。首先,通过WB、免疫荧光、染色质免疫沉淀法（chromatin immunoprecipitation,Ch IP）、酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）对VDR核转位、Atg16l1的转录调控及对小鼠抗菌肽（m CRAMP）调控的进行研究;然后,通过WB法、免疫共沉淀法（co-immunoprecipitation,Co-IP）、ELISA对VDR与NF-κB p65相互作用进行研究。结果显示,AS可抑制VDR对其靶基因Atg16l1的转录负调控作用、对m CRAMP的调控,进而调控自噬过程;AS可以与VDR结合,从而抑制VDR的核转位并增加NF-κB p65的核转位,提高前炎症细胞因子的释放。本研究明确了AS对脓毒症诱导的免疫抑制的保护作用,并深入研究其分子机制的研究。研究结果显示,AS可显着降低CLP诱导的免疫抑制二次打击模型小鼠的死亡率,提高CLP诱导的免疫抑制小鼠及CLP诱导的免疫抑制二次打击模型小鼠清除细菌的能力和前炎症细胞因子水平,该作用与其提高单核/巨噬细胞细胞自噬水平密切相关;AS通过与VDR相互作用,从两方面发挥逆转脓毒症诱导的免疫抑制状态:（1）AS与VDR相互作用,抑制VDR的核转位及其对下游靶基因Atg16l1、m Cramp的调控,增强自噬相关分子的表达,增强细胞自噬过程;（2）AS与VDR相互作用,从而抑制VDR与NF-κB p65在细胞胞浆中的相互作用,促进NF-κB p65入核,提高致炎细胞因子基因的转录表达。结合我们课题组前期研究,我们认为AS不仅可以在脓毒症细胞因子风暴阶段作为一个抗炎药物,发挥抗炎作用;而且能够在免疫抑制阶段作为一个免疫增强药,提高机体前炎症细胞因子水平及清除细菌的能力,发挥双向免疫调节作用。因此,青蒿琥酯值得作为一种针对脓毒症全病程的双向免疫调节药进行更深入的研究。
赖芳[4]（2020）在《从胆碱能抗炎通路探讨电针足三里对脓毒症肺损伤的作用及机制》文中认为急性肺损伤（ALI）是危重症常见并发症,临床可引发急性呼吸窘迫综合征,脓毒症是引发ALI的主要病因之一。脓毒症ALI发病率高,死亡率高,临床救治困难,目前仅保护性通气策略、限制性液体管理是有循证医学证据支持可改善预后的措施,尚无药物可明确改善脓毒症ALI预后。寻求对脓毒症ALI有效的干预措施是研究的热点之一。中医药治疗脓毒症、ALI等危重症有着悠久的历史,现代中医救治危重症亦有较多进展。目前多数医家将其归于“暴喘”、“喘脱”范畴,无论中医内治法、外治法均多有长足发展。通过系统整理脓毒症ALI的中西医研究进展,我们发现,针刺足三里在干预脓毒症ALI有一定优势。为进一步系统整理现有文献情况,本研究参考SYRCLE动物实验系统评价的方法对文献中针刺足三里干预脓毒症ALI的动物实验文献进行整理,并在此基础上优化设计动物实验并开展研究,提出从胆碱能抗炎通路探讨针刺足三里对脓毒症ALI的作用及机制,为进一步临床研究及应用提供科学依据。目的:1.全面、系统、客观地评价目前针刺足三里干预脓毒症ALI的已有文献报道情况,总结证据特点,在此基础上优化设计动物实验。2.实验证实针刺足三里对脓毒症ALI的作用,并从胆碱能抗炎通路（CAP）探讨针刺足三里对脓毒症ALI的作用机制。方法:1.参考SYRCLE动物实验系统评价的方法,在PubMed、Cochrane图书馆（CENTRAL）、Embase（Excerpt Medica Database）、中国生物医学文献服务系统（CBM）、中国知网（China National Knowledge Infrastructure,CNKI）、万方医学网（Wanfang Data）和维普数据库（VIP Database）7个数据库从建库到2019年5月31日的文献进行系统地检索、筛选、整理有关针刺足三里干预脓毒症ALI的动物实验文献,总结现有实验结果设计、结果情况,分析影响实验结果的因素,结合文献调研情况,优化设计动物实验方案设计,以进一步探讨针刺足三里对脓毒症ALI的作用及机制。2.参照美国胸科协会对脓毒症ALI动物造模的推荐方式及造模成功评判标准,采用脂多糖（LPS）气道内滴入的方法构建大鼠脓毒症ALI模型,进行生存分析,共60只大鼠随机分为4组:假模型组、电针组、模型+同期麻醉组、模型+非同期麻醉组,每组15只。假模型组给予生理盐水气道内滴入;电针组于气道内滴入LPS造模后30min给予执行电针30min,每日1次,共执行3次;模型+同期麻醉组于LPS气道内滴入造模后,每次电针组执行电针时同期给予麻醉药麻醉;模型+非同期麻醉组于造模后不予任何干预。观察各组大鼠生存情况至造模后第7天。3.同上方法及标准构建大鼠脓毒症ALI模型,进行机制探讨,共35只大鼠随机分为7组:假模型组、模型组、电针组、PNU组（使用CAP通路关键受体α 7nAChR激动剂PNU-282987）、MLA组（使用α 7nAChR拮抗剂甲基牛扁亭）、PNU+电针组、MLA+电针组,每组5只。假模型组给予生理盐水气道内滴入;电针组于造模后30min给予电针30min 1次、造模后24h取材前30min执行电针治疗1次,PNU组、MLA组于造模后30min分别给予PNU-282987、甲基牛扁亭腹腔注射,PNU+电针组、MLA+电针组分别于造模后30min给予相应药物腹腔注射并给予电针30min 1次,造模后24h取材前30min执行电针治疗1次。造模后24h取材,收集大鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）,离心后上清液用于BALF蛋白含量测定,细胞沉淀重悬后涂片行白细胞、中性粒细胞计数;称取肺组织湿重及烤干至恒重重量计算肺组织湿干重比;血液离心取上清测定血清蛋白含量,与BALF蛋白含量比较计算肺毛细血管蛋白渗漏程度;取采用肺组织切片HE染色观察肺组织病理改变;采用ELISA法检测血清炎症因子IL-6、IL-10含量;采用Western Blot方法检测肺组织NF-κB蛋白水平、α 7nACHR蛋白水平;以组织活性测试盒（南京建成）测定肺组织ChAT、AChE活性。结果:1.动物实验系统评价结果:从7个数据库共检索获得4417篇文献,按照纳入、排除标准,通过标题、摘要筛选获得74篇文献,通过全文获取及阅读最后共纳入19篇文献。（1）目前关于针刺足三里干预脓毒症肺损伤的动物实验文献大多数（约63%）为5年之前发表,肺损伤评价指标相对粗浅、单一,疗效评估未足够全面;（2）19篇文献中仅4篇文献采用足三里单穴进行干预,其余均配以其他穴位进行干预,针刺足三里穴的作用效果未能充分明确;（3）针刺干预时机89.5%的文献为造模前预处理,仅10.5%为造模后立即针刺干预,与临床实际可切入干预时机相距甚远;（4）机制研究方面不够深入,可结合针刺足三里在脓毒症方面的其他研究结果进一步深入探讨;（5）文献的总体质量较低,偏倚风险较高。根据当前研究进展及系统评价结果,提出采用合适、稳健的脓毒症肺损伤模型,通过死亡率、较全面的肺损伤评价指标评价通过足三里单穴进行造模后等待再行干预处理的效果,并从胆碱能抗炎通路对作用机制进行探讨。2.动物实验结果:（1）生存分析:无论是与模型+同期麻醉组还是与模型+非同期麻醉组相比,电针组7天生存率明显提高（P<0.05）。（2）肺组织病理评分:模型组较假模型组明显升高（P<0.01）;与模型组相比,电针组、PNU组、PNU+电针组大鼠肺组织病理评分明显下降,差异有统计学意义（P<0.01）,电针组下降趋势更明显;MLA组、MLA+电针组与模型组相比,差异无统计学意义（P>0.05）。（3）肺组织湿/干重比:模型组较假模型组明显升高（P<0.01）;与模型组相比,电针组肺湿/干重比明显下降,差异有统计学意义（P<0.05）,其余各组差异无统计学意义（P>0.05）。（4）BALF白细胞计数、中性粒细胞计数:模型组较假模型组均明显升高（白细胞,P<0.05;中性粒,P<0.01）;与模型组相比,电针组BALF中白细胞、中性粒细胞有下降趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）。（5）肺毛细血管蛋白渗漏程度:模型组较假模型组明显升高（P<0.01）;与模型组相比,电针组肺毛细血管蛋白渗漏程度下降,差异有统计学意义（P<0.05）,其余各组差异无统计学意义（P>0.05）。（6）ELISA炎症因子检测:血清IL-6、IL-10水平模型组较假模型组均明显升高（均P<0.01）;与模型组相比,电针组血清IL-6水平明显下降（P<0.05）,其余各组差异无统计学意义（P>0.05）;IL-10水平各组间差异无统计学意义（P>0.05）。（7）肺组织ChAT活性检测:模型组较假模型组明显降低（P<0.01）;与模型组相比,电针组肺组织ChAT活性明显升高（P<0.05）。（8）肺组织AChE活性检测:模型组较假模型组明显降低（P<0.01）;与模型组相比,电针组肺组织AChE活性有上升趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）。（9）肺组织NF-κ B蛋白表达:模型组较假模型组明显升高（P<0.05）;与模型组相比电针组肺组织NF-κ B表达明显下降（P<0.05）,其余各组与模型组差异无统计学意义（P>0.05）。（10）肺组织α 7nAChR蛋白表达:假模型组、模型组、电针组肺组织α 7nAChR蛋白表达无明显差异（P>0.05）,其余各组较上述三组均明显升高（P<0.05）。结论:1.目前文献研究提示电针足三里可能可减轻脓毒症肺损伤,但尚未较全面、系统进行验证,机制研究不够深入,胆碱能抗炎通路可能是电针足三里发挥作用的重要通路。2.本研究以LPS气道内滴入建立脓毒症ALI大鼠模型,模型构建成功。在模型构建成功的基础上验证电针足三里干预的有效性,与模型组相比,电针足三里可改善脓毒症ALI大鼠7天死亡率,造模后24h肺损伤明显减轻。3.通过检测胆碱能抗炎通路关键调控因子的活性,本研究发现,电针足三里可显着提高脓毒症肺损伤大鼠肺组织ChAT活性,降低肺组织NF-κ B表达水平,降低炎症因子IL-6的水平,进一步通过与使用胆碱能抗炎通路关键受体α 7nAChR激动剂及拮抗剂的组别比较,发现电针足三里可能是通过神经电刺激促进神经递质乙酰胆碱的生成和释放而产生激活胆碱能抗炎通路发挥抗炎作用,而不是通过影响α 7nAChR表达或增强α 7nAChR与受体激动剂结合等机制产生作用。
杨鸟[5]（2019）在《氯化两面针碱通过抑制TOP1促进IL-10表达治疗内毒素血症的研究》文中研究表明1、研究背景和目的内毒素血症是一种由内毒素（主要成分为脂多糖,LPS）进入血液引起的急性病症。LPS在血液中会激活巨噬细胞、树突状细胞等,使其大量释放促炎细胞因子,导致补体系统和凝血系统异常活化,引起多器官的微血管循环障碍、弥漫性血管内凝血、休克甚至死亡。白介素-10（interleukin-10,IL-10）是一种重要的免疫调节因子,在内毒素血症中能抑制巨噬细胞等的活化和促炎细胞因子的产生,抑制过激的免疫反应,减少炎症损伤。IL-10可以在内毒素血症的临床试验中降低促炎细胞因子水平,在内毒素血症小鼠中也能抑制炎症反应,提高生存率。中药两面针是芸香科植物两面针（Zanthoxylum nitidum）的干燥根,用于跌打损伤、牙龈炎、风湿病等的治疗。氯化两面针碱（nitidine chloride,NC）是两面针的主要活性成分。课题组前期研究发现NC能促进LPS刺激下树突状细胞中IL-10的表达。本研究旨在确定NC调控IL-10的作用特征,考察其作用靶点和作用机制,并在小鼠内毒素血症模型中考察其体内抗炎活性。2、研究方法（1）NC调控IL-10表达的作用特征研究本研究使用了RAW264.7巨噬细胞系、THP-1单核细胞系和原代细胞骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）、腹腔巨噬细胞。在采用CCK8实验、乳酸脱氢酶实验和Annexin V-PI染色测定NC的细胞毒性后,我们在无毒性剂量范围内考察了NC调控上述免疫细胞表达IL-10的时间特征和浓度依赖性。IL-10 mRNA水平采用荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）测定,IL-10蛋白分泌量采用酶联免疫吸附实验（ELISA）测定。（2）NC通过抑制TOP1调控IL-10的靶标研究首先,我们用拓扑异构酶1（topoisomeraseⅠ,TOP1）和超螺旋DNA测定了NC对TOP1酶活性的抑制作用。其次,我们测定了TOP1抑制剂拓扑替康（Topotecan,TPT）和伊立替康（irinotecan,CPT-11）的活性代谢物SN-38的细胞毒性及对IL-10表达量的影响。接着,我们以含TOP1干扰shRNA的慢病毒转染THP-1细胞,以蛋白免疫印迹和qPCR测定了其对TOP1基因的敲减效果。最后,我们考察了TOP1敲减对NC、SN-38、TPT调控IL-10表达的影响。（3）考察NC和TOP1抑制剂在小鼠内毒素血症模型中的作用首先,我们以LPS腹腔注射Balb/c雄性小鼠构建内毒素血症模型,考察无毒剂量下的NC、CPT-11和TPT对小鼠生存率的影响。其次,使用ELISA测定了小鼠血清中IL-10和促炎细胞因子TNF-α、IL-6的浓度,使用qPCR测定了IL-10、TNF-α和IL-6在肝和肺组织中的表达水平。接着,我们使用了IL-10敲除小鼠和Anti-IL-10抗体来研究IL-10的作用。在这两种条件下测定了NC和TOP1抑制剂对小鼠生存率和血清促炎细胞因子的影响。最后,在IL-10缺陷的腹腔巨噬细胞和Anti-IL-10抗体封闭的RAW264.7细胞中,考察了NC和TOP1抑制剂对促炎细胞因子的调控。（4）NC和TOP1抑制剂促进IL-10表达的作用机制研究首先,采用mRNA降解实验考察NC和TOP1抑制剂对IL-10 mRNA稳定性的影响。其次,采用蛋白免疫印迹实验测定了NC和TOP1抑制剂对PI3K-Akt通路的活化,并使用通路抑制剂考察该通路在NC和TOP1抑制剂调控IL-10表达中发挥的作用。接着,我们使用洗脱实验考察了NC和TOP1抑制剂调控IL-10表达的可逆性,使用彗星实验和H2AX,ATM,ATR和Akt磷酸化水平来测定药物引起的DNA损伤应答。最后,我们运用ATM和ATR抑制剂阻断DNA损伤应答,测定这对于NC和TOP1抑制剂调控IL-10表达的影响。3、研究结果（1）NC在无毒剂量范围内（14μM）能浓度依赖地增强RAW264.7巨噬细胞、THP-1单核细胞、BMDCs和腹腔巨噬细胞在LPS刺激下IL-10的表达,这些细胞均是髓系免疫细胞。NC在无LPS刺激时无法单独促进IL-10的表达,NC预作用时间低于9 h时也无法增强IL-10的表达。（2）在体外酶活实验中,NC能抑制TOP1酶的活性。在髓系免疫细胞中,无细胞毒剂量的TOP1抑制剂SN-38（25-100 nM）和TPT（50-200 nM）也能显着提高LPS刺激下的IL-10 mRNA水平和IL-10蛋白分泌量,与NC的效果类似。以shRNA敲减TOP1基因会增强IL-10的表达,且会阻断NC、SN-38、TPT对IL-10表达的上调。（3）在小鼠内毒素血症模型中,无毒剂量的NC（5 mg/kg）和TOP1抑制剂CPT-11（10 mg/kg）,TPT（0.5 mg/kg）能显着提高小鼠的生存率至7080%。内毒素血症模型小鼠和空白对照小鼠相比,血清和肝、肺组织中促炎细胞因子产生量激增,IL-10表达量也有所增多;给予NC和TOP1抑制剂可进一步促进IL-10的产生,抑制促炎细胞因子TNF-α和IL-6的产生。在IL-10敲除小鼠和AntiIL-10抗体处理的普通小鼠的内毒素血症模型中,NC和CPT-11无法显着提高小鼠生存率,且对促炎细胞因子TNF-α和IL-6的抑制作用显着减弱,在IL-10敲除小鼠的腹腔巨噬细胞和Anti-IL-10抗体处理的RAW264.7细胞中,NC和SN-38对促炎细胞因子的抑制作用也显着减弱。这意味着IL-10参与了药物作用下促炎细胞因子的下调,且介导了药物的治疗作用。（4）在LPS刺激的RAW264.7细胞中,NC和TOP1抑制剂显着提高了IL-10 mRNA水平,但并不影响IL-10 mRNA的降解。使用通路抑制剂考察LPS刺激下调控IL-10表达的多条通路发现,PI3K/Akt通路在NC上调IL-10表达中发挥着关键作用。NC和TOP1抑制剂均可浓度依赖地促进Akt的活化和其下游GSK3β、CREB的磷酸化从而促进IL-10表达,PI3K和Akt抑制剂可阻断药物对IL-10的上调。在内毒素血症小鼠模型中,NC也通过活化Akt来促进IL-10表达和发挥治疗作用。NC和TOP1抑制剂可在无细胞毒浓度下引起DNA损伤,增强H2AX磷酸化,激活DNA损伤应答,从而促进ATM、ATR和Akt的活化。在LPS刺激的条件下,H2AX磷酸化减弱,ATM、ATR和Akt的磷酸化加强,从而增强IL-10的表达。使用ATM和ATR抑制剂阻断DNA损伤应答会阻止NC和TOP1抑制剂促进IL-10表达,且会增加药物的细胞毒性。4、结论与意义天然产物NC可通过抑制TOP1而促进髓系免疫细胞在LPS刺激下表达IL-10。临床使用的TOP1抑制剂SN-38、TPT也能发挥类似的效果。NC和TOP1抑制剂在小鼠内毒素血症模型中能通过促进IL-10表达来抑制促炎细胞因子TNF-α和IL-6的产生,减少肝、肺炎症损伤,提高小鼠生存率。NC和TOP1抑制剂能够在无细胞毒性的较低剂量下,引起可修复的DNA损伤,激活DNA损伤应答中关键激酶ATM和ATR,进而促进Akt的活化,从而增强LPS刺激下IL-10的转录和表达。本研究考察了NC调控IL-10表达的靶点和在内毒素血症中的抗炎活性,发现了TOP1抑制剂能在无毒剂量下发挥的体内抗炎活性,这为内毒素血症的防治提供了新的候选药物。此外,在研究NC和TOP1抑制剂调控IL-10的作用机制的过程中,本研究将DNA损伤应答与炎症反应联系了起来,指出可修复的DNA损伤可能带来抗炎的有利作用。
刘继松[6]（2019）在《人脐带血间充质干细胞外泌体改善烧伤大鼠急性肺损伤的作用机制研究》文中指出背景与目的烧伤是指由热力、电能、化学物质、放射线等引起的组织伤害,主要是皮肤和粘膜的伤害。烧伤常常引起机体严重的炎症反应和器官损害。烧伤患者最常见的器官损伤并发症为肺部感染,严重烧伤后,机体的免疫功能下降,导致肺部感染加重,死亡率升高。急性肺损伤（Acute lung ingury,ALI）是大面积深度烧伤患者最常见的并发症之一,可引起机体缺氧,且患者极易发生急性呼吸窘迫综合征（Acute respiratory distress syndrome,ARDS）,这也是造成烧伤患者高死亡率的原因之一。既往的研究发现,严重烧伤后肺组织损伤并发症发生发展的重要病理机制主要是炎症反应、氧化应激和肺组织细胞凋亡。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）通过分化、自我更新和免疫调节能力,作为一种很有潜力治疗人类疾病的细胞,受到了广泛关注,在开发各种疾病治疗的新方法方面也具有巨大的潜力。MSCs可以从骨髓、脂肪组织、脐带和血液中等分离出来。然而,由于这些细胞的致瘤作用,其临床应用受到限制。研究显示,骨髓间充质干细胞的治疗效果在很大程度上取决于旁分泌因子,外泌体（exosome）。exosome是一种含有脂类、小分子RNA和蛋白质的纳米双层膜结构,在细胞间通讯中起着重要作用。由于其具有较低的免疫原性、致瘤性和易于管理等优点,exosome已成为一种新的有希望替代全细胞治疗的方法。此外,有研究显示,exosome可通过抗氧化、抗炎及抑制细胞凋亡发挥治疗人类疾病的作用。因此,本研究旨在探讨人脐带间充质干细胞（human unbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs）衍生的外泌体改善烧伤所致ALI的作用及其分子机制。方法在本研究中,购买的hUCMSCs培养3-5代后收集培养液上清,通过超速离心法分离出hUCMSCs-Exo。获得的hUCMSCs-Exo通过透射电镜、纳米粒子跟踪分析进行形态和大小分析,蛋白免疫印迹对exosome的特异性标志物CD63和CD9进行检测。采用qRT-PCR检测hUCMSCs和hUCMSCs-Exo中miR-451的表达。hUCMSCs中采用脂质体转染试剂分别转染miR-451 inhibitor及其对照序列（inhibitor NC）,收集两组细胞的外泌体,即NCI-Exo和miR-451I-Exo。体内实验在大鼠中进行,大鼠分6组:sham,burn,burn+PBS,burn+Exo,burn+NCI-Exo,burn+miR-451I-Exo,burn通过热水烫伤法制备出总体面积30%III度烫伤模型,Exo注射组采用尾静脉注射hUCMSCs-Exo。在治疗后6h,检测各组大鼠肺功能指数差异;在治疗后6h,12h,24h和48h,分别收集各组大鼠外周血,ELISA检测血清中炎症因子IL-6,IL-1β和TNF-α的水平。在治疗后的24h和48h,分别处死大鼠,收集肺组织,ELISA检测肺组织匀浆中炎症因子IL-6,IL-1β和TNF-α的水平,氧化应激相关因子丙二醛（Malonaldehyde,MDA）的表达,髓过氧化物酶（Myeloperoxidase,MPO）和超氧化物歧化酶（Superoxide diamutase,SOD）的活性。通过HE染色观察肺组织的形态学变化。采用TUNEL法检测肺组织中细胞凋亡比例。采用蛋白免疫印迹检测TLR4/NF-κB信号通路的激活情况。结果1、从培养的hUCMSCs上清中成功分离出hUCMSCs-Exo,透射电镜显示其为球形囊泡,粒径分析其直径位于40-160nm,western blot结果显示其高表达exosome特异性标志物CD63和CD9。2、qRT-PCR证明hUCMSCs-Exo中miR-451富集表达,且抑制了miR-451后的hUCMSCs,其分泌的exosome中miR-451的表达也显着减少（p<0.05）。3、肺功能指数分析显示,与sham组相比,burn组大鼠最大吸气量减少,中心气道阻力增加,肺顺应性降低（p<0.05）。而Exo注射治疗后,可显着提高大鼠最大吸气量,降低中心气道阻力,且提高其肺顺应性（p<0.05）。此外,抑制了miR-451后的exosome注射对大鼠的肺功能改善明显减弱。4、血清中炎症因子表达检测显示,在不同的时间点,烫伤后的大鼠血清中IL-6,IL-1β和TNF-α的表达均显着增加（p<0.05）,Exo注射后的大鼠,其炎症因子表达下降（p<0.05）,抑制了miR-451后的exosome注射对血清中炎症因子的抑制作用减弱。此外,IL-6和IL-1β的水平在烫伤后6h达到最大值,随着时间延长,逐渐降低。与IL-6和IL-1β不同的是,TNF-α的水平在24h时达到最大值。5、肺组织中炎症因子的表达检测显示,与sham组相比,burn组大鼠肺组织匀浆中炎症因子表达水平显着增加（p<0.05）,Exo注射的大鼠肺组织中炎症因子表达水平得到抑制（p<0.05）,而抑制了miR-451后的exosome注射对炎症因子的抑制作用明显减弱。6、对TLR4/NF-κB信号通路的激活情况分析显示,burn组大鼠肺组织中TLR4/NF-κB信号通路呈激活状态,即TLR4和p-p65的表达显着上调（p<0.05）。Exo注射可显着抑制TLR4/NF-κB信号通路（p<0.05）,而抑制了miR-451后的exosome注射对TLR4/NF-κB信号通路的抑制作用减弱。7、氧化应激相关分子表达/活性检测的结果显示,burn组大鼠肺组织中MDA水平和MPO活性均显着上调,SOD活性显着降低（p<0.05）。Exo注射后显着抑制了MDA水平和MPO活性,提高了SOD活性（p<0.05）,而miR-451IExo的抗氧化作用显着减弱。8、HE染色观察肺组织病理损伤,sham组大鼠肺组织呈淡粉红色,肺组织结构清晰完成,肺泡壁薄无水肿,间质血管无扩张。Burn组可见肺泡结构明显紊乱且不完整,肺组织水肿,肺间质增厚。Exo注射组大鼠的肺组织及间质结构较完整,肺泡及肺间质的水肿有所减轻。对肺组织的损伤评分结果显示:burn组大鼠肺组织损伤显着大于sham组（p<0.05）,Exo注射的大鼠肺组织损伤评分有显着减少（p<0.05）,而抑制了miR-451后的exosome,其注射后的大鼠肺组织损伤评分显着增加（p<0.05）。9、肺组织凋亡细胞比例:TUNEL检测结果显示,burn组大鼠肺组织中细胞凋亡比例明显高于sham组（p<0.05）,Exo注射的大鼠肺组织中凋亡细胞的比例显着减少（p<0.05）,而miR-451I-Exo的抗凋亡作用显着减弱。结论1、本文从hUCMSCs中分离的exosome,是直径在40-160nm大小的具有膜结构的微小囊泡,表达外泌体共有的特异性蛋白CD63和CD9。2、hUCMSCs通过外泌体传递miR-451抑制烫伤大鼠体内TLR4/NF-κB信号通路激活和炎症因子表达;3、hUCMSCs通过外泌体传递miR-451降低烫伤大鼠体内氧化应激水平;4、hUCMSCs通过外泌体传递miR-451减少烫伤大鼠肺组织细胞凋亡,有效改善烫伤大鼠肺功能和肺组织损伤;
孟令鹏[7]（2019）在《基于TLR4信号通路探讨化瘀方调控miRNA-146a对脓毒症大鼠心肌保护作用机制研究》文中研究指明目的:通过尾静脉注射脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）建立脓毒症大鼠模型,探究化瘀方对脓毒症大鼠炎症因子的影响以及对脓毒症大鼠的心肌保护作用,并通过进一步检测化瘀方对脓毒症大鼠心肌TLR4信号通路蛋白及miRNA-146a的表达,探究化瘀方对脓毒症大鼠心肌保护的作用机制,为临床治疗脓毒症提供新的思路和方法。方法:实验一:取清洁级健康雄性Wistar大鼠24只,随机分为:空白组、模型组、化瘀方中药组,每组8只。空白组:大鼠预灌胃生理盐水1周,每天1次,并于第8天给予尾静脉注射生理盐水;模型组:大鼠预灌胃生理盐水1周,每天1次,并于第8天给予尾静脉注射LPS进行脓毒症造模;中药组:大鼠预灌胃化瘀方中药1周,每天1次,并于第8天给予尾静脉注射LPS进行脓毒症造模。观察并记录大鼠造模后的一般状况,造模成功6h后取材,ELISA检测各组大鼠血清炎症因子TNF-α、IL-1的水平,将大鼠心肌组织切片进行HE染色,显微镜下观察心肌组织病理学改变。实验二:取清洁级健康雄性Wistar大鼠32只,随机分为:miRNA-146a阴性剂对照组、miRNA-146a阴性剂+中药组、miRNA-146a抑制剂组、miRNA-146a抑制剂+中药组。miRNA-146a阴性剂对照组:大鼠预灌胃生理盐水1周,每天1次,第8天给予尾静脉注射LPS进行脓毒症造模,造模前24h给予尾静脉注射miRNA-146a antagomir-nc;miRNA-146a阴性剂+中药组:大鼠预灌胃中药1周,每天1次,第8天给予尾静脉注射LPS进行脓毒症造模,造模前24h给予尾静脉注射miRNA-146a antagomir-nc;miRNA-146a抑制剂组:大鼠预灌胃生理盐水1周,每天1次,第8天给予尾静脉注射LPS进行造模,造模前24h给予尾静脉注射miRNA-146a antagomir进行miRNA-146a低表达处理;miRNA-146a抑制剂+中药组:大鼠预灌胃中药1周,每天1次,第8天给予尾静脉注射LPS进行脓毒症造模,造模前24h给予尾静脉注射miRNA-146a antagomir进行miRNA-146a低表达处理。造模成功6h后取材,RT-PCR检测各组大鼠血清miRNA-146a的表达,ELISA检测各组大鼠血清炎症因子TNF-α、IL-1的水平,Western Blot检测心肌组上海中医药大学硕士学位论文织TLR4、NF-κB蛋白表达,将大鼠心肌组织切片进行HE染色,显微镜下观察心肌组织病理学改变。结果:实验一结果1、动物造模后一般情况观察:与空白组大鼠相比,模型组大鼠和中药组大鼠都出现了食欲减退,饮水减少,精神萎靡,反应迟钝等的情况,但中药组大鼠的精神反应活动要优于模型组2、各组大鼠心肌组织病理学改变:脓毒症模型组大鼠心肌细胞肿胀破裂,胞核溢出破裂,心肌纤维断裂,排列不齐,可见炎性细胞侵润。中药组大鼠心肌损伤情况相比模型组大鼠减轻,心肌损伤情况得到改善,但仍有水肿和炎症细胞侵润,部分心肌细胞破裂。3、各组大鼠TNF-α、IL-1检测结果显示:与空白组相比,中药组和模型组大鼠血清炎症因子TNF-α、IL-1的水平明显升高,差异具有显着统计学意义（P<0.01）;与模型组相比,中药组大鼠血清炎症因子TNF-α、IL-1的水平,明显降低,差异具有显着统计学意义（P<0.01）。实验二结果1、动物造模后一般情况观察:四组大鼠均出现食欲减退,饮水减少,精神萎靡,毛色发黄,反应迟钝等情况,但是miRNA-146a抑制剂+中药组大鼠的情况优于miRNA-146a抑制剂大鼠,miRNA-146a阴性剂+中药组大鼠情况优于miRNA-146a阴性剂对照组大鼠。2、各组大鼠心肌组织病理学改变:各组大鼠心肌细胞都出现结构不完整,胞核破裂坏死,心肌纤维断裂,排列不齐,炎症因子侵润,组织充血水肿等的情况。miRNA-146a抑制剂组大鼠心肌损伤最为严重。miRNA-146a抑制剂+中药组大鼠心肌损伤情况相比miRNA-146a抑制剂组大鼠减轻。3、各组大鼠血清miRNA-146a、TNF-α、IL-1检测结果显示:与miRNA-146a阴性剂对照组相比,miRNA-146a抑制剂组大鼠miRNA-146a的表达降低,差异具有显着统计学意义（P<0.01）,miRNA-146a阴性剂+中药组大鼠miRNA-146a的表达升高（P<0.01）;与miRNA-146a抑制剂组大鼠相比,miRNA-146a抑制剂+中药组大鼠miRNA-146a的表达水平升高（P<0.01）;与miRNA-146a阴性剂对照组大鼠相比,miRNA-146a抑制剂组大鼠血清炎症因子TNF-α、IL-1的水平升高（P<0.01）,miRNA-146a阴性剂+中药组大鼠血清炎症因子TNF-α、IL-1的水平降低（P<0.01）;与miRNA-146a抑制剂组大鼠相比,miRNA-146a抑制剂+中药组大鼠血清炎症因子TNF-α、IL-1的水平降低（P<0.01）。4、各组大鼠心肌组织TLR4、NF-κB蛋白检测结果显示:与miRNA-146a阴性剂对照组大鼠相比,miRNA-146a抑制剂组大鼠心肌组织TLR4、NF-κB蛋白水平升高（P<0.01）,miRNA-146a阴性剂+中药组大鼠心肌组织TLR4、NF-κB蛋白水平降低（P<0.01）;与miRNA-146a抑制剂组大鼠相比,miRNA-146a抑制剂+中药组大鼠心肌组织TLR4、NF-κB蛋白水平降低（P<0.01）。结论:1、化瘀方中药可以减少脓毒症大鼠炎症因子TNF-α、IL-1的释放,降低脓毒症大鼠炎症反应,并减轻脓毒症大鼠心肌的损伤。2、miRNA-146a在脓毒症中可以负反馈调控TLR4信号通路,miRNA-146a被抑制的情况下可以增加TLR4信号通路蛋白的表达,并提高炎症因子TNF-α和IL-1的水平,致使炎症反应加剧,导致脓毒症大鼠心肌损伤进一步加重。3、化瘀方中药通过上调miRNA-146a的表达进一步负反馈调节TLR4信号通路,降低信号通路上TLR4和NF-κB蛋白的表达,并减少炎症因子TNF-α和IL-1的释放,减轻脓毒症带来过度炎症反应,对脓毒症大鼠心肌具有保护作用。
柳益书[8]（2019）在《外源性一氧化碳释放分子（CORM-2）通过NF-κB信号通路在胰腺损伤中的保护作用》文中研究指明【研究背景】脓毒症（sepsis）是指由严重感染、创伤、烧伤、术后感染及急危重病引起的全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）,并伴有危及生命的器官功能障碍,进一步可发展成为严重脓毒症、脓毒性休克及多器官功能障碍综合征（multiple organs dysfunction syndrome,MODS）,甚至死亡。当下,由脓毒症引起的脓毒症休克和多器官功能障碍已成为重症监护病房（intensive care unit,ICU）的最常见死因之一。由于脓毒症的发病机制极其复杂,即便在转化医学高度发展的今天,临床治疗依然收效甚微,死亡率高居不下。因此,进一步探讨脓毒症的发生机制、寻找到新的预防、治疗手段已成为亟需解决的重要科学问题。急性胰腺炎（Acute Pancreatitis,AP）是一种由多种病因导致胰酶在胰腺内被激活后引起胰腺组织自身消化、水肿、出血甚至坏死的炎症反应,临床表现多样,变化范围可从经支持治疗后轻症自限性的疾病到高并发症和死亡率的威胁生命的疾病。脓毒症是继发重症胰腺损伤的重要原因,胰腺急性损伤后可引起炎症介质大量释放,加剧机体炎症反应及应激状态,使病情进一步恶化。尽管经大量临床及试验潜在治疗药物或手术处理,其中约1020%病人死于多器官衰竭,这在一定程度上由于治疗AP可供选择的药理学选择缺乏。研究显示胰酶的活化、炎症、氧化应激及核因子NF-κB是AP的重要病理生理组成。一氧化碳（Carbonmonoxide,CO）作为继一氧化氮以后发现的第二种重要的气体第二信使分子,其具有舒张血管和支气管平滑肌、抑制血小板聚集、抑制炎症反应、抗凋亡、抗增殖等多种生理学作用,在神经、呼吸、循环等生理过程和抑制急性炎性反应、脏器缺血再灌注损伤、器官移植排斥反应等病理过程中发挥着重要调节作用。一氧化碳释放分子（CO-releasing molecules,CORM-2）是一类新合成的可以释放一氧化碳气体的过渡金属化合物,其可释放一氧化碳所以受到越来越多的关注并可能发展其药用。已有研究结果显示CORM-2释放的CO可以显着的改善盲肠结扎并穿孔（CLP）小鼠以及LPS刺激小鼠的炎症反应,有效保护小鼠重要脏器减少损伤,改善机体缺血再灌注,提高实验小鼠的生存率。然而,关于一氧化碳释放分子在改善炎性反应,减少胰腺损伤的保护机制方面,即细胞信号通路问题上的研究,目前尚未有报道。基于此,本研究主要是分析了一氧化碳在脓毒症小鼠模型和重症胰腺炎小鼠模型所致胰腺损伤的保护作用,并探讨了NF-κB细胞通路在这种保护作用中所起到的分子机制。【研究方法】研究CORM-2对CLP模型小鼠胰腺的保护作用。清洁级健康雄性C57BL/6小鼠68只（其中48只用于生存率分析,20只其他实验）随机分成4组:假手术组（Sham）组,CLP组,CLP+CORM-2组及CLP+iCORM-2组,假手术组或CLP后即开始计,分别记录各组72h生存率,于1、2、4、6、8、10、12、16、20、24、36h测定各组小鼠血糖水平,并且在第6小时、12小时及24小时对小鼠进行异氟烷麻醉下心脏穿刺采血,最后取胰腺组织于液氮中冻存或用10%福尔马林固定,用于后续实验。利用全自动生化分析仪检测检测血清淀粉酶、脂肪酶的水平,取胰腺组织HE染色并进行病理学评分,检测过氧化物酶（MPO）活力。C57BL/6小鼠腹腔注射雨蛙素（50μg/kg）每小时一次,共10次,建立ANP小鼠模型;将模型小鼠分组为对照组（Control组）,急性出血坏死性胰腺炎（ANP组）,CORM-2干预组（AP+CORM-2组）,iCORM-2干预组（AP+iCORM-2组）。CORM-2或iCORM-2于第一次注射雨蛙素30min后,各组均于第一次雨蛙素注射12小时后收集小鼠血液及胰腺组织。运用全自动生化仪检测血清中淀粉酶、脂肪酶、AST、ALT的水平,对胰腺组织进行HE染色,TUNEL法检测胰腺组织凋亡,称重法检测胰腺组织湿干比,分光光度计检测胰腺组织中MPO（髓过氧化物酶）的活性,使用酶标仪对胰腺组织中MDA（丙二醛）进行检测。采用ELISA法检测重症胰腺炎模型小鼠血浆及胰腺组织中细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）水平,免疫组化的方法检测胰腺组织中ICAM-1及VCAM-1的表达情况,运用Western blot方法对NF-κB、P-IκBα的水平进行检测。【研究结果】（1）CORM-2的干预对可改善CLP模型的生存率,对于血糖影响不明显。与Sham小鼠相比,CLP术后血清淀粉酶水平在6 h即开始升高,在CLP术后24 h后增加更为明显。在CLP术后6 h、12h和24 h,CORM-2的干预均能显着降低了血清淀粉酶的水平。与CLP组相比,使用iCORM-2治疗的脓毒症小鼠的血清淀粉酶活性没有改变。在血清脂肪酶水平上也有类似的结果;通过对各组小鼠胰腺组织HE染色结果显示:Sham组小鼠的胰腺显示正常的结构,而脓毒症小鼠的胰腺组织在CLP术24h表现出严重的病理损伤。脓毒症小鼠的胰腺组织具有典型的水肿、炎性细胞浸润和腺泡细胞坏死。在CORM-2干预后,显着降低了胰腺损伤的组织学损伤的程度,而在iCORM-2治疗组中没有发现胰腺损伤的减轻。MPO活性检测的结果显示:与假手术组相比,CLP术后6 h、12 h和24h,小鼠胰腺组织MPO活性明显增加,并在24 h时更加明显。CORM-2的治疗可明显减弱MPO活性,CORM-2的治疗降低了胰腺组织中性粒细胞的浸润。CLP组与CLP+iCORM-2组之间无显着性差异。上述结果提示在脓毒症时,胰腺组织亦是易受损害的器官之一,CORM-2干预对这一损害有一定的保护作用,而胰腺组织病理学评分的定量分析说明与CLP组相比,CORM-2治疗在CLP诱导的胰腺损伤中发挥了保护作用。（2）通过雨蛙素连续腹腔注射成功建立急性出血坏死性胰腺炎小鼠模型。CORM-2能够明显降低雨蛙素诱导的ANP小鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平,减轻腺泡细胞的凋亡（TUNEL）,减轻胰腺组织损伤;CORM-2能够明显的提高雨蛙素诱导的ANP小鼠生存率。以上结果提示,CORM-2可明显的保护急性出血性坏死性胰腺炎小鼠的脏器功能,提高小鼠生存率。（3）与假手术组相比,脓毒症小鼠胰腺组织促炎细胞因子IL-6,IL-1β及TNF-α显着增加,CORM-2干预,胰腺组织IL-6、IL-1β和TNF-α的表达减少,然而,iCORM-2治疗不施加任何影响这些细胞因子的表达。脓毒症小鼠NF-κB p65及磷酸化的-IκB-α（p-IκB-α）表达水平明显升高,而CORM-2干预则抑制了其表达,而iCORM-2干预对此无改变。CORM-2能够明显降低雨蛙素诱导的ANP小鼠减轻血清及胰腺组织细胞因子水平（TNF-α、IL-1β、IL-6）的表达,CORM-2能够明显的抑制雨蛙素诱导的ANP小鼠胰腺组织NF-κB p65及磷酸化的-IκB-α（p-IκB-α）表达水平,抑制因NF-κB活化、表达所导致的炎症反应、氧化应激产物增多。综上,本研究采用小鼠脓毒症模型和急性胰腺炎的胰腺损伤模型,对胰腺炎症反应进行了系统的研究,并使用CORM-2进行干预,提示了CORM-2通过抑制NF-κB信号通路的活化来抑制机体的炎症反应,从而对脓毒症和胰腺炎时胰腺组织的损伤起保护作用。【研究结论】本研究发现,脓毒症时,小鼠胰腺组织血管内皮细胞表面附着的ICAM-1、VCAM-1明显增多,蛋白NF-κB的表达量也明显增多,CORM-2干预可以明显的抑制上述炎症指标,这种保护作用是通过NF-κB细胞信号通路而发生作用的。
肖蓉[9]（2014）在《中药方“蒲和饮”对小鼠的抗炎效果及抗炎机制研究》文中研究指明炎症反应（Inflammation）作为生物机体对致炎因子所发生的自动的防御反应,主要表现为红（Redness）、肿（Swelling）、执（Heat）、痛（Pain）和功能障碍（Loss of Function）五大医学临床症候,尤其是发热、红肿、疼痛这些临床症候与中医的“热”证型如高热、汗出、舌红苔黄、肌肤生疮等症候相似。据中医的病因病机观点,“阳胜则热”,机体感受热邪、或外感寒邪化热、或内有郁积化热而致“热”证,中医对“热”证（炎症）的治则多以清热解毒、活血化瘀、通络止痛等,具有这些功效的中药如金银花、连翘、蒲公英等,被称为“抗炎中药”。虽然“抗炎中药”已表现出良好的临床治疗效果,但由于这类中药的抗炎机制不明确,加上中医方剂的变化,使“抗炎中药”的应用受到严重制约。因此,应用现代医学和分子生物学的理论和技术研究“抗炎中药”,以明确“抗炎中药”的抗炎机制,为“抗炎中药”能在医学或兽医学临床上广泛应用提供基础。本试验根据中医清热解毒、活血化瘀的治则,拟定中药方“蒲和饮”。通过建立小鼠炎症模型,观察中药方”蒲和饮”对炎症模型小鼠的治疗效果,并应用病理组织学技术、实时荧光定量RT-PCR （Real-time Quantitative RT-PCR）技术、酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay, ELISA）技术研究“蒲和饮”的抗炎效果及抗炎固有免疫机制,以期明确其抗炎作用靶点,为其进一步研发提供依据。主要研究结果如下1.中药方“蒲和饮”抗炎效果研究为研究中药方剂“蒲和饮”对炎症的抑制效果,本试验通过建立二甲苯致小鼠耳廓肿胀模型和10%鲜鸡蛋清致小鼠足趾肿胀模型来研究“蒲和饮”的对急性炎症抑制效果,并确定最佳用药剂量。结果表明,中药方剂“蒲和饮”能显着降低二甲苯炎症模型小鼠的耳廓肿胀度和肿胀率（P<0.01）；其“蒲和饮”高剂量（160mg/kg）、中剂量（8Omg/kg）、低剂量（40mg/kg）组对小鼠耳廓肿胀抑制率分别为38.01%、48.37%、20.22%。中药方“蒲和饮”也能显着降低10%鲜鸡蛋清致足趾肿胀模型小鼠的足趾肿胀率,与模型组比较差异极显着（P<0.01）,其“蒲和饮”高、中、低剂量组在注射蛋清后4h的肿胀抑制率均达到最高,分别为44.51%、57.38%、32.39%。结果提示,中药方“蒲和饮”对二甲苯和鲜鸡蛋清所致的炎症具有显着的抑制作用。2小鼠脓毒症模型的建立及中药方”蒲和饮”对小鼠脓毒症的干预效果通过腹腔注射LPS建立小鼠脓毒症模型,进行“蒲和饮”的干预试验研究。试验设立对照组、模型组和药物干预组。观察造模后6-72h不同时间点小鼠的临床症状为：造模6h后小鼠开始出现精神沉郁、被毛凌乱、行动迟缓、呼吸加快等：剖检发现小鼠皮下充血、出血,肠出血,肝脏色泽苍白、部分可见白色点状坏死等。使用中药“蒲和饮”干预后,LPS脓毒症小鼠的临床症状和剖检症状较模型组显着减轻。病理组织学分析表明,造模12h后,可见小鼠肝细胞出现明显变性肿胀,细胞边界及细胞核模糊不清或消失,炎性细胞浸润,肝细胞脂肪样变性,可见凋亡细胞,肝窦明显淤血,48h后,病变情况开始逐渐减轻,72h可见较多双核肝细胞；使用“蒲和饮”干预后的,其肝小叶结构较清楚,肝细胞排列稍微紊乱,少数肝细胞发生轻度变性水肿,少量炎性细胞浸润,中央静脉少许扩张有淤血,余未见异常变化。表明中药方“蒲和饮”对小鼠LPS脓毒症具有一定的干预效果。3“蒲和饮”对LPS脓毒症小鼠肝组织中TLR4及下游相关信号分子mRNA表达量的影响分子固有免疫的研究证明,TLR4为LPS的主要模式识别受体,可通过TLR4/MyD88/NF-κB信号途径引起机体的免疫反应作用。本试验通过分析TLR4/MyD88/NF-KB信号通路中各重要节点分子表达量的变化,初步确定“蒲和饮”发挥抗炎作用的固有免疫机制并判定该方剂的作用靶标。荧光定量RT-PCR方法检测小鼠肝组织中TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-10和HMGB1mRNA表达水平的结果显示：LPS脓毒症造模后,LPS脓毒症小鼠与阴性对照组比较,TLR4、MyD88、NF-κB等基因mRNA表达水平均不同程度升高,分别于18、18、18、12、24、24h达峰值,与阴性对照组的差异极显着（P<0.01）。在使用“蒲和饮”干预后的12、18、24、24、24h时间段,“蒲和饮”干预脓毒症模型小鼠肝组织中LR4、MyD88、NF-κB、 TNF-α、HMGB1mRNA表达水平均显着低于脓毒症模型组小鼠（P<0.05或P<0.01）,IL-10的表达水平均高于模型组小鼠,36h与模型组比较差异显着（P<0.05）。研究表明,“蒲和饮”可能是通过TLR4/MyD88/NF-KB信号通路,抑制LPS受体TLR4、及信号转导分子MyD88、转录因子NF-κB、促炎细胞因子TNF-a及晚期炎症介质HMGB1表达,促进抗炎细胞因子IL-10的表达,达到抑制炎症反应。提示TLR4/MyD88/NF-KB信号通路中MyD88、NF-κB等各节点分子可作为抗炎中药“蒲和饮”的作用靶标。4“蒲和饮”对LPS脓毒症小鼠血清TNF-a、IL-10、PGE2、HMGB1含量的影响在研究中药方“蒲和饮”影响TLR4/MyD88/NF-KB信号通路中重要节点分子mRNA在组织中表达情况的同时,本试验采用双抗体夹心ELISA方法检测了不同时间点小鼠的血清中TNF-α、IL-10、PGE2、HMGB1等重要相关因子蛋白的表达水平。结果显示,LPS脓毒症模型小鼠血清中TNF-α、IL-10、PGE2及HMGB1浓度高于阴性对照组,分别于12h、24h、8h、24h达峰值。以“蒲和饮”对脓毒症模型小鼠干预治疗,“蒲和饮”干预组小鼠血清中TNF-α含量在12h、24h显着低于脓毒症模型组（P<0.05）,IL-10水平在18h、48h显着高于脓毒症模型组（P<0.05,P<0.01）,PGE2含量在18h、24h、36h显着低于脓毒症模型组（P<0.01,P<0.05）,HMGB1水平在24h极显着低于脓毒症模型组（P<0.01）。研究表明,“蒲和饮”可显着抑制LPS脓毒症模型小鼠血清中TNF-α、PGE2、HMGB1的合成与释放,促进IL-10的合成与释放。提示“蒲和饮”可通过调节外周血中TNF-α、IL-10、PGE2和HMGB1等重要相关因子蛋白合成与释放来发挥抗炎作用,且外周血中TNF-α、IL-10、HMGB1等重要相关因子蛋白含量的变化与组织中TNF-α、IL-10、HMGB1等相应因子mRNA表达的变化相一致。
黄立锋[10]（2008）在《烧伤后高迁移率族蛋白B1对调节性T细胞免疫功能影响的实验与临床研究》文中研究表明目的:实验一:（1）采用严重烫伤延迟复苏动物模型,明确高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的变化及其与调节性T细胞（Treg）免疫功能的关系。（2）通过严重烫伤延迟复苏动物模型,阐明HMGB1对Treg分化成熟的受体作用机制。（3）探讨严重烫伤延迟复苏后HMGB1介导的Treg对树突状细胞（DC）免疫功能的影响及调节作用。（4）探讨严重烫伤延迟复苏后HMGB1介导的Treg对T淋巴细胞免疫功能的影响及调节途径。（5）观察丙酮酸乙酯（EP）对重度烫伤延迟复苏动物免疫功能及脏器损害的可能保护效应。实验二:（1）对临床严重烧伤患者进行动态监测,明确严重烧伤后病人外周血HMGB1、Treg分化成熟以及T淋巴细胞免疫功能的变化规律,探讨HMGB1、Treg及T淋巴细胞免疫功能改变在患者烧伤后发生脓毒症及不良预后中所起的作用及临床意义。（2）探讨严重烧伤后HMGB1、Treg及T淋巴细胞免疫指标间的相互关系及可能的作用机制。方法:1.采用重度烫伤延迟复苏动物模型,即雄性清洁级Wistar大鼠,浸于沸水中造成30%体表面积Ⅲ度烫伤。伤后延迟6小时抗休克复苏,在伤后6小时从腹腔给予林格液（40 ml/kg）抗休克治疗,此外在烫伤后12、24、36、48小时分别给予4 ml/次林格液腹腔内注射。实验分组:136只大鼠随机分为5组,（1）正常对照组（n=8）:麻醉后活杀;（2）假烫伤组（n=32）;（3）烫伤组（n=32）;（4）EP治疗组（n=32）:EP加入林格液中随补液给药（EP为28 mM）;（5）晚期糖基化终末产物受体（RAGE）抗体（1 mg/ml）治疗组（n=32）:烫伤后6、24小时从阴茎背静脉给予RAGE抗体（1 mg/kg）治疗。以上后4组实验动物再分为4个亚组,分别于烫伤后1、3、5、7天处死动物,无菌留取血和脾脏标本。分离血清,-20℃贮存。脾脏一部分无菌、无酶液氮冻存,另一部分用于提取Treg、DC和T淋巴细胞。Treg、DC的分离纯化采用MiniMACS免疫磁性分离系统进行。利用B细胞和单核细胞具有易粘附于尼龙纤维表面的特性,分离T淋巴细胞。采用流式细胞术检测细胞免疫表型和细胞表面受体,MTT法检测脾T淋巴细胞增殖,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清、细胞孵育上清及组织匀浆液的细胞因子和T淋巴细胞活化的核因子（NF）-kB。采用荧光定量PCR检测目的基因表达水平。2.对106例烧伤总面积大于或等于30%的患者进行动态观察,对所采集临床病历资料进行分析。实验分组:（1）按烧伤总面积将患者分为三组:Ⅰ组41例（烧伤总面积30%～49%）,Ⅱ组34例（烧伤总面积50%～69%）,Ⅲ组31例（烧伤总面积70%～99%）;（2）根据烧伤脓毒症的诊断标准,将患者进一步分为脓毒症组（59例）与非脓毒症组（47例）;（3）根据脓毒症患者的预后情况,将其分为死亡组（17例）与存活组（42例）。同时设正常对照组（25位健康献血员）。分别于烧伤后1、3、7、14、21天采集患者外周静脉血,分离外周血T淋巴细胞,采用MiniMACS免疫磁性分离系统对外周血Treg进行分离纯化,同时分离血清,-20℃贮存。采用流式细胞术检测细胞免疫表型,MTT法检测T淋巴细胞增殖活性,ELISA检测血清HMGB1及细胞孵育上清的细胞因子水平,采用荧光定量PCR检测目的基因表达水平。结果:实验一:（1）烫伤延迟复苏导致动物脾脏HMGB1基因、蛋白表达和血清HMGB1水平在伤后1～7天显着升高,脾组织中HMGB1含量第1天达峰值,血清HMGB1水平于第3天达峰值。EP干预后烫伤动物脾脏HMGB1基因、蛋白表达和血清HMGB1水平1～7天均明显降低。RAGE抗体干预对烫伤动物脾脏和血清HMGB1无明显影响。（2）严重烫伤后脾脏Treg表面分子CTLA-4的表达1～5天明显增强,表面标记物Foxp3的表达1～7天明显增高,与假烫伤动物比较差异显着,表明严重烫伤可促使Treg成熟。EP及RAGE抗体干预组动物脾脏Treg表面CTLA-4和Foxp3的表达明显降低,与烫伤组比较均有统计学差异,提示EP处理和RAGE抗体干预可抑制Treg成熟。（3）严重烫伤后1～7天动物脾脏Treg表面RAGE的表达明显增强。EP干预后脾脏Treg表面RAGE的表达于1～7天显着降低,但仍明显高于假烫伤组。RAGE抗体干预后Treg表面RAGE表达1～7天显着降低。（4）烫伤延迟复苏后动物脾脏IL-10 mRNA表达以及Treg孵育液中IL-10含量明显增高。EP或RAGE抗体干预后,烫伤动物脾脏IL-10 mRNA表达和Treg孵育液中IL-10含量在伤后1～7天明显降低。（5）严重烫伤后1～7天脾脏DC表面CD80的表达与假烫伤组比较无统计学差异,CD86表达明显增强,MHCⅡ的表达仅在伤后第1天明显增高,DC摄取葡聚糖的能力与假烫伤组比较1～7天明显减低,表明DC向成熟发展,但表型表达不完全。EP或RAGE抗体干预后烫伤动物脾脏DC表面CD80、MHCⅡ的表达1～7天均明显升高,CD86的表达仍保持较高,DC摄取葡聚糖的能力在1～7天仍较低,表明DC成熟,表型表达趋于正常。（6）烫伤延迟复苏后1～7天脾T淋巴细胞增殖反应受抑制,IL-2mRNA表达1、3天无改变,5、7天明显降低,分泌IL-2的量1～7天显着下降,IL-2RαmRNA、IL-2Rα蛋白表达1～5天明显降低。EP或RAGE抗体干预能明显减轻1～7天烫伤对脾T淋巴细胞增殖的抑制,并且IL-2 mRNA表达、IL-2的分泌和IL-2RαmRNA、IL-2Rα表达明显上升。（7）严重烫伤后动物脾T淋巴细胞分泌IL-4的量比假烫伤组明显增加,而分泌IFN-γ的量显着降低,提示严重烫伤后T淋巴细胞向Th2漂移。用EP或RAGE抗体干预后,烫伤动物脾T淋巴细胞分泌IL-4的量明显下降,分泌IFN-γ水平则明显升高,提示EP或RAGE抗体干预可使烫伤后T淋巴细胞向Th1漂移。（8）烫伤组与假烫伤组比较,大鼠脾脏T淋巴细胞NF-kB活性伤后1～7天明显降低。应用EP或RAGE抗体干预均可明显提高1～7天烫伤动物脾T淋巴细胞NF-kB活性。（9）烫伤组与假烫伤组比较,大鼠血中丙氨酸转氨酶（ALT）、天门冬氨酸转氨酶（AST）及心肌激酶（CK-MB）伤后1～7天明显升高,血中肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）1～5天明显升高。EP或RAGE抗体干预可明显降低烫伤后动物血清ALT、AST、Cr、BUN及CK-MB含量。（10）脾组织中HMGB1含量与Treg表面CTLA-4、Foxp3、RAGE、IL-10的表达呈正相关。脾组织中HMGB1含量与脾T淋巴细胞增值反应、表面IL-2Rα表达、孵育上清中IL-2、IFN-γ含量、NF-kB活性呈负相关,与血清sIL-2R含量、孵育上清中IL-4含量呈正相关。血清HMGB1含量与血清生化指标ALT、AST、Cr、BUN及CK-MB水平均呈正相关。实验二:（1）与正常对照组比较,严重烧伤患者不同烧伤面积组T淋巴细胞HMGB1基因表达及血浆HMGB1水平均明显升高,Ⅰ组与Ⅲ组比较存在明显差异;严重烧伤患者伤后各时间点HMGB1基因表达及血浆HMGB1水平均明显升高,脓毒症组HMGB1基因表达及血浆HMGB1水平在伤后7～21天显着高于非脓毒症组;脓毒症患者死亡组HMGB1基因表达及血浆HMGB1水平在伤后3～21天显着高于存活组。（2）与正常对照组比较,严重烧伤患者各烧伤面积组Treg表面分子CTLA-4及标记物FOXP3表达均明显增强,各组间比较存在明显差异;严重烧伤患者伤后不同时间点CTLA-4及FOXP3表达均明显升高,脓毒症组CTLA-4及FOXP3表达在伤后3～21天显着高于非脓毒症组;脓毒症患者死亡组CTLA-4及FOXP3表达在伤后3～21天显着高于存活组。（3）与正常对照组比较,严重烧伤患者不同烧伤面积组Treg IL-10基因/蛋白表达及TGF-β1水平均显着升高,各组间比较存在明显差异;严重烧伤患者伤后各时间点Treg IL-10基因/蛋白表达及TGF-β1水平均明显升高,脓毒症组Treg IL-10基因/蛋白表达及TGF-β1水平在伤后3～21天显着高于非脓毒症组;脓毒症患者死亡组Treg IL-10基因/蛋白表达及TGF-β1水平在伤后3～21天显着高于存活组。（4）与正常对照组比较,严重烧伤患者各烧伤面积组外周血T淋巴细胞增殖反应活性及IL-2基因/蛋白表达水平均明显降低,Ⅰ组与Ⅲ组比较存在明显差异;严重烧伤患者伤后T淋巴细胞增殖反应活性及IL-2基因/蛋白表达水平均明显降低,脓毒症组T淋巴细胞增殖反应活性及IL-2基因/蛋白表达水平在伤后3～21天显着低于非脓毒症组;脓毒症患者死亡组T淋巴细胞增殖反应活性及IL-2基因/蛋白表达水平在伤后3～21天显着低于存活组。（5）与正常对照组比较,严重烧伤患者各烧伤面积组T淋巴细胞分泌IL-4水平明显升高,而分泌IFN-γ水平显着降低;与Ⅰ组比较,Ⅲ组IL-4分泌水平明显升高,而IFN-γ分泌水平显着降低;严重烧伤患者伤后各时间点T淋巴细胞分泌IL-4水平明显升高,而分泌IFN-γ水平显着降低;脓毒症组T淋巴细胞分泌IL-4/IFN-γ水平在伤后3～21天显着高/低于非脓毒症组;脓毒症患者死亡组T淋巴细胞分泌IL-4/IFN-γ水平在伤后3～21天显着高/低于存活组。（6）血浆HMGB1含量与Treg及T淋巴细胞各实验组相关免疫指标均无明显相关性。Treg各实验组免疫指标（部分或全部）与T淋巴细胞分泌IL-4水平呈正相关,与T淋巴细胞增值反应活性、IL-2及IFN-γ分泌水平呈负相关。结论:实验一:（1）HMGB1在严重烫伤后具有升高较晚、持续时间较长的特征。HMGB1可能参与了烫伤后脓毒症所致多器官损害的发病过程。（2）HMGB1的持续升高可刺激Treg向成熟发展,从而介导T淋巴细胞增殖反应低下,并向Th2漂移,免疫功能抑制。（3）烫伤后大量的HMGB1可能主要通过受体RAGE介导Treg表型表达、Treg功能成熟。（4）HMGB1介导的Treg功能成熟可影响烫伤后DC细胞向成熟发育,但其表型表达异常,功能出现障碍。（5）HMGB1介导的Treg功能成熟还可通过下调T淋巴细胞NF-kB活性而减少了IL-2基因表达和蛋白合成,进而影响T淋巴细胞的增殖反应和免疫功能。（6）EP可能主要通过抑制HMGB1的合成释放,改善烫伤延迟复苏动物细胞免疫功能紊乱,保护动物的主要脏器功能。实验二:（1）HMGB1在严重烧伤后具有增高较晚、持续时间较长的特征,其含量与烧伤严重程度、并发脓毒症及患者预后相关,HMGB1参与了严重烧伤后机体免疫紊乱、发生脓毒症并致患者死亡的病理过程。（2）严重烧伤后Treg功能向成熟发展,使其免疫抑制功能充分发挥,从而可能导致机体的免疫功能紊乱。其表面分子表达及细胞因子分泌在不同烧伤面积、是否并发脓毒症及是否存活等不同组间存在显着差异,Treg可通过分泌抑制性细胞因子参与了严重烧伤后机体免疫失衡、诱发脓毒症甚至最终造成患者死亡的病理过程。（3）严重烧伤后T淋巴细胞免疫功能受到抑制,并引起T淋巴细胞向Th2漂移。烧伤程度越重、脓毒症发生率和患者死亡率越高,机体免疫抑制状态也越明显。（4）HMGB1含量与Treg及T淋巴细胞相关免疫指标均无明显相关,而Treg免疫指标与T淋巴细胞免疫功能指标间存在显着相关性（正相关或负相关）。说明Treg可能对严重烧伤后T淋巴细胞免疫功能低下,并出现Th1向Th2极化现象具有重要影响。
二、NF-κB抑制剂对烫伤脓毒症大鼠致炎/抗炎细胞因子表达的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、NF-κB抑制剂对烫伤脓毒症大鼠致炎/抗炎细胞因子表达的影响（论文提纲范文）
（1）调控HCAR1介导的免疫反应对MSCs移植治疗脓毒症的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1.材料与方法 |
| 2.临床实验 |
| 3.动物实验 |
| 4.统计学分析 |
| 5.实验结果 |
| 6.讨论 |
| 7.结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 乳酸介导HCAR1(GPR81)在脓毒症免疫炎症反应中的调节作用 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（2）基于PI3K-Ⅰ和PI3K-Ⅲ的动态变化规律研究青蒿琥酯抗炎作用的分子机制（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 AS 对 LPS 诱导的前炎症细胞因子释放的抑制作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 第二章 LPS对 PI3K-Ⅰ、PI3K-Ⅲ及其介导的相关信号通路上关键分子 mRNA 表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 第三章 LPS对 PI3K-Ⅰ、PI3K-Ⅲ磷酸化水平的影响及 AS 的干预作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 全文讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 脓毒症及其免疫治疗 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）青蒿琥酯对脓毒症免疫抑制模型小鼠保护作用的分子机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词对照表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 青蒿琥酯对CLP诱导的免疫抑制模型小鼠的保护作用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 小结 |
| 第三章 青蒿琥酯逆转LPS耐受巨噬细胞的体外作用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 小结 |
| 第四章 与青蒿琥酯相互作用分子的预测、筛选及确认 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.3 小结 |
| 第五章 青蒿琥酯通过VDR逆转脓毒症免疫抑制的分子机制研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.3 小结 |
| 全文讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 维生素D与脓毒症 |
| 参考文献 |
| 研究生期间相关成果 |
| 致谢 |
（4）从胆碱能抗炎通路探讨电针足三里对脓毒症肺损伤的作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 脓毒症急性肺损伤的现代医学研究进展 |
| 1.1.1 定义及流行病学 |
| 1.1.2 发病机制 |
| 1.1.3 脓毒症急性肺损伤的西医治疗进展 |
| 1.2 脓毒症急性肺损伤的中医研究进展 |
| 1.2.1 祖国医学对脓毒症急性肺损伤的认识 |
| 1.2.2 祖国医学对脓毒症急性肺损伤的治疗进展 |
| 1.3 针刺足三里干预脓毒症急性肺损伤的研究进展 |
| 1.3.1 针刺足三里干预脓毒症急性肺损伤的中医理论基础 |
| 1.3.2 针刺足三里干预脓毒症急性肺损伤的西医理论依据及研究进展 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 针刺足三里对实验性脓毒症急性肺损伤的系统评价 |
| 2.1 研究目的 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 检索策略 |
| 2.2.2 纳入与排除标准 |
| 2.2.3 数据提取与偏倚风险评价 |
| 2.3 研究结果 |
| 2.3.1 纳入文献筛选流程及结果 |
| 2.3.2 纳入研究的基本特征 |
| 2.3.3 研究质量和发表偏倚 |
| 2.3.4 疗效评价 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 影响针刺足三里改善脓毒症急性肺损伤作用的因素 |
| 2.4.2 针刺足三里改善脓毒症急性肺损伤的结局指标的选择及机制探讨 |
| 2.4.3 局限性 |
| 2.4.4 进一步实验研究的方案优化 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 从胆碱能抗炎通路探讨电针足三里对脓毒症急性肺损伤的作用及机制研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要仪器 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要试剂配制 |
| 3.2 实验动物 |
| 3.3 实验流程及方案 |
| 3.3.1 实验流程图 |
| 3.3.2 实验分组 |
| 3.3.3 造模方法 |
| 3.3.4 干预措施 |
| 3.4 取材、指标观察与检测 |
| 3.4.1 血清样本收集 |
| 3.4.2 支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)收集 |
| 3.4.3 BALF白细胞计数及中性粒细胞计数计算 |
| 3.4.4 肺组织取材 |
| 3.4.5 肺组织病理切片、苏木素-伊红(HE)染色 |
| 3.4.6 肺组织毛细血管蛋白渗漏程度评估 |
| 3.4.7 肺湿/干重比值 |
| 3.4.8 酶联免疫吸附法(ELISA)检测 |
| 3.4.9 肺组织病理评分 |
| 3.4.10 肺组织乙酰胆碱转移酶(ChAT)活性检测 |
| 3.4.11 肺组织乙酰胆碱酯酶(AChE)活性检测 |
| 3.5 统计分析 |
| 3.6 结果 |
| 3.6.1 一般现象观察及生存分析 |
| 3.6.2 肺组织病理结果 |
| 3.6.3 大鼠肺组织湿/干重比(wet/dry ratio,W/D) |
| 3.6.4 BALF白细胞(WBC)、中性粒细胞(NEU)计数 |
| 3.6.5 肺毛细血管蛋白渗漏程度 |
| 3.6.6 ELISA检测结果 |
| 3.6.7 ChAT、AChE活性检测 |
| 3.6.8 Western Blot检测结果 |
| 3.7 小结 |
| 3.8 讨论 |
| 3.8.1 ALI动物模型的评判标准 |
| 3.8.2 本实验采用的脓毒症ALI动物造模方式的理论依据及模型构造情况 |
| 3.8.3 干预措施以外的影响因素 |
| 3.8.4 肺脏局部CAP参与电针足三里对脓毒症ALI的调节 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间科研成果及奖励 |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）氯化两面针碱通过抑制TOP1促进IL-10表达治疗内毒素血症的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 NC促进LPS刺激下IL-10 的表达 |
| 一、引言 |
| (一)IL-10 的免疫调节功能 |
| (二)两面针及氯化两面针碱 |
| (三)氯化两面针碱与炎症 |
| 二、实验材料 |
| (一)实验细胞株 |
| (二)实验试剂 |
| (三)仪器与设备 |
| 三、实验方法 |
| (一)实验动物饲养及伦理 |
| (二)原代细胞的制备及培养 |
| (三)传代细胞系的培养 |
| (四)细胞毒性的测定 |
| (五)ELISA测定IL-10 蛋白浓度 |
| (六)qPCR测定IL-10 mRNA水平 |
| (七)数据处理和统计学分析 |
| 四、实验结果 |
| (一)NC的细胞毒性考察 |
| (二)NC调控IL-10 表达的时间特征 |
| (三)NC浓度依赖地促进IL-10表达 |
| 五、小结与讨论 |
| 第二章 NC通过抑制TOP1 促进IL-10 表达 |
| 一、引言 |
| (一)拓扑异构酶I |
| (二)TOP1 抑制剂 |
| (三)TOP1 抑制剂与炎症 |
| 二、实验材料 |
| (一)实验细胞株 |
| (二)实验试剂 |
| (三)仪器与设备 |
| 三、实验方法 |
| (一)拓扑异构酶I酶活性的测定 |
| (二)细胞因子表达测定 |
| (三)TOP1 干扰shRNA载体的构建 |
| (四)干扰慢病毒的制备 |
| (五)慢病毒转染THP-1 细胞 |
| (六)Western Blots |
| (七)数据处理和统计学分析 |
| 四、实验结果 |
| (一)NC可抑制TOP1 酶活性 |
| (二)TOP1 抑制剂增强LPS刺激下IL-10 的表达 |
| (三)TOP1 干扰慢病毒的构建及干扰效果考察 |
| (四)TOP1敲减对TOP1 抑制剂调控IL-10 的影响 |
| 五、小结与讨论 |
| 第三章 NC和 TOP1 抑制剂治疗小鼠内毒素血症 |
| 一、引言 |
| (一)内毒素血症及其动物模型 |
| (二)内毒素血症与细胞因子 |
| 二、实验材料 |
| (一)实验细胞株 |
| (二)实验试剂 |
| (三)仪器与设备 |
| 三、实验方法 |
| (一)动物实验处理及伦理 |
| (二)内毒素血症模型建立 |
| (三)小鼠血清及组织提取和细胞因子测定 |
| (四)组织H-E染色 |
| (五)IL-10 敲除小鼠和Anti-IL-10 抗体封闭 |
| (六)数据处理和统计学分析 |
| 四、实验结果 |
| (一)NC和 TOP1 抑制剂提高内毒素血症小鼠的生存率 |
| (二)NC和 TOP1 抑制剂影响小鼠体内细胞因子产生 |
| (三)IL-10 介导了NC和 TOP1 抑制剂的抗炎作用 |
| (四)IL-10 影响了NC和 TOP1 抑制剂对促炎细胞因子的调控 |
| 五、小结与讨论 |
| 第四章 NC和 TOP1 抑制剂通过增强PI3K-AKT通路活化促进IL-10 表达 |
| 一、引言 |
| (一)IL-10 表达的调控 |
| 二、实验材料 |
| (一)实验细胞株 |
| (二)实验试剂 |
| (三)仪器与设备 |
| 三、实验方法 |
| (一)细胞培养 |
| (二)mRNA降解测定和半衰期计算 |
| (三)细胞因子含量测定 |
| (四)Western Blots |
| (五)单细胞凝胶电泳 |
| (六)小鼠模型中PI3K-Akt通路考察 |
| 四、实验结果 |
| (一)NC和 TOP1 抑制剂增强转录促进IL-10 表达 |
| (二)PI3K-Akt通路在NC调控IL-10 表达中发挥重要作用 |
| (三)NC和 TOP1 抑制剂增强LPS刺激下PI3K-Akt通路的活化 |
| (四)PI3K-Akt通路介导了NC和 TOP1 抑制剂对IL-10 的上调 |
| (五)NC通过活化PI3K-Akt通路缓解小鼠内毒素血症 |
| (六)NC和 TOP1 抑制剂通过PI3K-Akt通路抑制促炎细胞因子 |
| 五、讨论 |
| 第五章 NC和 TOP1 抑制剂通过激活DNA损伤应答促进IL-10表达 |
| 一、引言 |
| (一)TOP1 抑制剂调控机制 |
| (二)DNA损伤应答 |
| 二、实验材料 |
| (一)实验细胞株 |
| (二)实验试剂 |
| (三)仪器与设备 |
| 三、实验方法 |
| (一)细胞培养 |
| (二)细胞因子含量测定 |
| (三)Western Blots |
| (四)单细胞凝胶电泳 |
| 四、实验结果 |
| (一)NC和 TOP1 抑制剂调控IL-10 的可逆性考察 |
| (二)NC在无毒剂量下引起DNA损伤 |
| (三)NC和 TOP1 抑制剂激活DNA损伤应答 |
| (四)阻断DNA损伤应答会影响NC和 TOP1 抑制剂的药效 |
| 五、讨论 |
| 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
（6）人脐带血间充质干细胞外泌体改善烧伤大鼠急性肺损伤的作用机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词(Abbreviation) |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 人脐带血间充质干细胞(hUCMSCs)外泌体的分离及鉴定 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 hUCMSCs-Exo的浓度及形态鉴定 |
| 3.2 hUCMSCs-Exo粒径分析 |
| 3.3 exosome特异性标志物表达 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第二章 hUCMSCs-Exo对烧伤致ALI大鼠炎症反应的影响 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 hUCMSCs及hUCMSCs-Exo中mi R-451 的表达 |
| 3.2 抑制 miR-451 后 hUCMSCs-Exo |
| 3.3 hUCMSCs-Exo抑制烫伤大鼠血清中IL-6 的表达 |
| 3.4 hUCMSCs-Exo抑制烫伤大鼠血清中IL-1β的表达 |
| 3.5 hUCMSCs-Exo抑制烫伤大鼠血清中TNF-α的表达 |
| 3.6 hUCMSCs-Exo抑制烫伤大鼠肺组织中炎症因子表达 |
| 3.7 hUCMSCs-Exo抑制烫伤大鼠肺组织中MDA含量 |
| 3.8 hUCMSCs-Exo抑制烫伤大鼠肺组织中MPO活性 |
| 3.9 hUCMSCs-Exo增加烫伤大鼠肺组织中SOD活性 |
| 3.10 大鼠肺组织中mi R-451 的表达 |
| 3.11 hUCMSCs-Exo抑制烫伤大鼠肺组织中TLR4/NF-κB信号通路 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第三章 hUCMSCs-Exo对烧伤大鼠急性肺损伤的影响 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 hUCMSCs-Exo改善烫伤大鼠肺功能 |
| 3.2 hUCMSCs-Exo抑制烫伤大鼠肺组织损伤 |
| 3.3 hUCMSCs-Exo减少烫伤大鼠肺组织中凋亡细胞比例 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 参考文献 |
| 附录 个人简介 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（7）基于TLR4信号通路探讨化瘀方调控miRNA-146a对脓毒症大鼠心肌保护作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 第一部分 化瘀方对脓毒症大鼠炎症反应的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验主要试剂 |
| 1.2 实验主要仪器耗材 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 “化瘀方”中药组成 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验大鼠分组 |
| 2.2 脓毒症造模方式 |
| 2.3 实验大鼠给药方式 |
| 2.4 实验大鼠造模后一般情况观察 |
| 2.5 实验大鼠取材 |
| 2.6 ELISA检测血清中TNF-α表达 |
| 2.7 ELISA检测血清中IL-1 表达 |
| 2.8 心肌组织HE染色 |
| 3 统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 造模后大鼠一般情况观察 |
| 4.2 各组大鼠血清TNF-α、IL-1 的表达 |
| 4.3 各组实验大鼠心肌病理学变化 |
| 5 分析讨论 |
| 5.1 脓毒症发病机制认识 |
| 5.2 中医对脓毒症的认识 |
| 5.3 化瘀方中药组成分析 |
| 5.4 化瘀方对脓毒症大鼠炎症反应的影响 |
| 第二部分 化瘀方对脓毒症大鼠心肌保护的机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验主要试剂 |
| 1.2 实验主要仪器和耗材 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 “化瘀方”中药组成 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 实验大鼠分组 |
| 2.2 脓毒症造模方式 |
| 2.3 实验大鼠给药方式 |
| 2.4 实验大鼠造模后一般情况观察 |
| 2.5 实验大鼠取材 |
| 2.6 RT-PCR检测血清mi RNA-146a的表达 |
| 2.7 ELISA检测血清中TNF-α、IL-1 表达 |
| 2.8 Western Blot检测心肌组织TLR4、NF-κB蛋白表达 |
| 2.9 心肌组织HE染色 |
| 3 统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 实验大鼠造模后一般情况观察 |
| 4.2 各组大鼠血清mi RNA-146a的表达 |
| 4.3 各组大鼠血清TNF-α、IL-1 表达 |
| 4.4 各组大鼠心肌组织TLR4、NF-κB的蛋白表达 |
| 4.5 各组实验大鼠心肌病理学变化 |
| 5 讨论分析 |
| 5.1 脓毒症心肌损伤机制 |
| 5.2 TLR4信号通路与脓毒症 |
| 5.3 化瘀方对脓毒症大鼠TLR4信号通路的影响 |
| 5.4 mi RNA-146a在脓毒症中负反馈调节TLR4 信号通路 |
| 5.5 化瘀方对脓毒症大鼠mi RNA-146a的影响 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 :文献综述 丹参及其活性成分对脓毒症心肌保护作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录二 :在校期间发表文章 |
（8）外源性一氧化碳释放分子（CORM-2）通过NF-κB信号通路在胰腺损伤中的保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩写检索 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 脓毒症概述 |
| 1.1.1 脓毒症的定义 |
| 1.1.2 脓毒症时微循环障碍 |
| 1.1.3 脓毒症的免疫失衡 |
| 1.1.4 脓毒症治疗新进展 |
| 1.2 胰腺损伤的概述 |
| 1.2.1 急性胰腺炎定义 |
| 1.2.2 胰腺损伤模型构建概述 |
| 1.3 HO系统以及CO的作用机制 |
| 1.3.1 HO系统 |
| 1.3.2 CO的作用机制 |
| 1.3.3 CO和 CORM的生物活性 |
| 1.4 炎性反应与NF-κB细胞通路 |
| 1.4.1 NF-κB信号通路概述 |
| 1.4.2 NF-κB信号通路的调节 |
| 1.4.3 NF-κB信号通路的在炎症性疾病中的临床应用 |
| 1.4.4 NF-κB信号通路的其他的临床应用 |
| 1.5 脓毒症、胰腺损伤与NF-κB细胞通路 |
| 1.6 本研究的目的方法实验设计及意义 |
| 1.6.1 研究目的 |
| 1.6.2 研究方法 |
| 1.6.3 研究意义 |
| 第二章 一氧化碳释放分子(CORM-2)对脓毒症下小鼠胰腺损伤的保护作用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 CORM-2 对脓毒症小鼠生存率的影响 |
| 2.2.2 CORM-2 对脓毒症小鼠血糖水平的影响 |
| 2.2.3 CORM-2 对脓毒症小鼠血清淀粉酶及脂肪酶水平的影响 |
| 2.2.4 CORM-2 对脓毒症小鼠胰腺组织损伤的作用 |
| 2.2.5 CORM-2 对脓毒症小鼠胰腺组织MPO活性的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 一氧化碳释放分子(CORM-2)对注射蛙皮素所致重症胰腺炎的小鼠胰腺损伤的保护作用 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 制造模型的基本情况 |
| 3.2.2 CORM-2 对雨蛙素诱导的ANP小鼠胰腺的保护作用分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 一氧化碳释放分子(CORM-2)对胰腺保护的NF-κB通路分子机制的研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 CORM-2对CLP诱导的脓毒症小鼠胰腺组织ICAM-1、VCAM-1 表达的影响 |
| 4.2.2 CORM-2对CLP诱导的脓毒症小鼠胰腺组织NF-κB和 P-I表达的影响 |
| 4.2.3 CORM-2 对雨蛙素诱导的重症急性胰腺炎小鼠胰腺组织及血清中细胞因子水平的影响 |
| 4.2.4 CORM-2 对雨蛙素诱导的重症急性胰腺炎小鼠胰腺组织ICAM-1、VCAM-1 表达的影响 |
| 4.2.5 CORM-2 对雨蛙素诱导的SAP小鼠胰腺组织NF-κB及 P-I的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 外源性一氧化碳释放分子在脓毒症小鼠所致胰腺损伤的保护机制 |
| 4.3.2 外源性一氧化碳释放分子在急性胰腺炎小鼠所致胰腺损伤的保护机制 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间发表的学术论文及其他科研成果 |
（9）中药方“蒲和饮”对小鼠的抗炎效果及抗炎机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 炎症概述 |
| 1.2 中药抗炎机制的研究现状 |
| 1.2.1 对血管活性胺类介质的影响 |
| 1.2.2 对花生四烯酸代谢产物的影响 |
| 1.2.3 对高迁移率蛋白B1的影响 |
| 1.2.4 对炎症细胞因子的影响 |
| 1.2.5 对核因子-κB的影响 |
| 1.3 脓毒症的信号转导途径及致病机制 |
| 1.4 中药抗脓毒症的研究现状 |
| 1.4.1 单味中药抗脓毒症的研究现状 |
| 1.4.2 中药方剂抗脓毒症的研究现状 |
| 第2章 引言 |
| 2.1 研究目的与意义 |
| 2.2 研究范围和内容 |
| 第3章 中药方“蒲和饮”抗炎效果研究 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 试验药物及试剂 |
| 3.1.3 试验器材 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 小鼠耳廓肿胀试验 |
| 3.2.2 小鼠足趾肿胀试验 |
| 3.2.3 统计学处理 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 中药方“蒲和饮”对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响 |
| 3.3.2 中药方“蒲和饮”对鸡蛋清致小鼠足趾肿胀的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 小鼠LPS脓毒症模型的建立及中药方“蒲和饮”对其干预作用 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 试验药物及试剂 |
| 4.1.3 试验仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 大肠杆菌内毒素LD50的测定 |
| 4.2.2 小鼠脓毒症模型的建立 |
| 4.2.3 分组及处理 |
| 4.2.4 样本采集及处理 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 大肠杆菌内毒素LD50的测定结果 |
| 4.3.2 小鼠造模后各组各时间点的临床症状及全身各组织病理变化 |
| 4.3.3 各组小鼠肝脏组织病理学变化 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 “蒲和饮”对LPS脓毒症模型小鼠肝组织TLR4及下游信号分子mRNA表达量的影响 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 试验动物 |
| 5.1.2 试验试剂及药材 |
| 5.1.3 试验仪器 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 试验分组 |
| 5.2.2 样本采集及处理 |
| 5.2.3 引物的合成 |
| 5.2.4 肝脏总RNA的提取及cDNA的合成 |
| 5.2.5 目的基因PCR扩增 |
| 5.2.6 脓毒症模型小鼠各时间点肝组织中TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-10、HMGB1 mRNA表达量的检测 |
| 5.2.7 数据分析处理 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1 小鼠肝脏中TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-10、HMGB1、β-actin基因mRNA的表达 |
| 5.3.2 “蒲和饮”对脓毒症模型小鼠肝脏TLR4-MyD88途径中TLRs、信号转导分子和炎性细胞因子mRNA表达水平的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 “蒲和饮”对LPS脓毒症小鼠血清TNF-A、IL-10、PGE2、HMGB1含量的影响 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.1.1 试验动物 |
| 6.1.2 试验试剂及药材 |
| 6.1.3 试验仪器 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 试验分组 |
| 6.2.2 样本采集及处理 |
| 6.2.3 血清中TNF-α、IL-10、PGE2、HMGB1含量检测 |
| 6.3 试验结果 |
| 6.3.1 “蒲和饮”对小鼠血清中TNFα含量的影响 |
| 6.3.2 “蒲和饮”对小鼠血清中IL-10含量的影响 |
| 6.3.3 “蒲和饮”对小鼠血清中PGE2含量的影响 |
| 6.3.4 “蒲和饮”对小鼠血清中HMGB1含量的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 第7章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录1 英文缩略词表 |
| 附录2 溶液配制 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间论文发表情况 |
（10）烧伤后高迁移率族蛋白B1对调节性T细胞免疫功能影响的实验与临床研究（论文提纲范文）
| 英文缩写词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 正文 |
| 实验一 HMGB1对烫伤延迟复苏大鼠脾脏调节性T细胞免疫功能的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 严重烧伤患者外周血HMGB1含量与调节性T细胞免疫功能的关系 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
四、NF-κB抑制剂对烫伤脓毒症大鼠致炎/抗炎细胞因子表达的影响（论文参考文献）
- [1]调控HCAR1介导的免疫反应对MSCs移植治疗脓毒症的作用研究[D]. 宣鹏飞. 内蒙古医科大学, 2021(02)
- [2]基于PI3K-Ⅰ和PI3K-Ⅲ的动态变化规律研究青蒿琥酯抗炎作用的分子机制[D]. 廖梦玲. 遵义医科大学, 2021(01)
- [3]青蒿琥酯对脓毒症免疫抑制模型小鼠保护作用的分子机制研究[D]. 尚圣兰. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [4]从胆碱能抗炎通路探讨电针足三里对脓毒症肺损伤的作用及机制[D]. 赖芳. 广州中医药大学, 2020(06)
- [5]氯化两面针碱通过抑制TOP1促进IL-10表达治疗内毒素血症的研究[D]. 杨鸟. 中国人民解放军海军军医大学, 2019(03)
- [6]人脐带血间充质干细胞外泌体改善烧伤大鼠急性肺损伤的作用机制研究[D]. 刘继松. 安徽医科大学, 2019(08)
- [7]基于TLR4信号通路探讨化瘀方调控miRNA-146a对脓毒症大鼠心肌保护作用机制研究[D]. 孟令鹏. 上海中医药大学, 2019(03)
- [8]外源性一氧化碳释放分子（CORM-2）通过NF-κB信号通路在胰腺损伤中的保护作用[D]. 柳益书. 江苏大学, 2019(03)
- [9]中药方“蒲和饮”对小鼠的抗炎效果及抗炎机制研究[D]. 肖蓉. 西南大学, 2014(01)
- [10]烧伤后高迁移率族蛋白B1对调节性T细胞免疫功能影响的实验与临床研究[D]. 黄立锋. 中国人民解放军军医进修学院, 2008(08)