一、口服Ⅱ型胶原诱导免疫耐受对大鼠类风湿性关节炎和创伤性骨性关节炎的影响（论文文献综述）
汪洋[1]（2021）在《LncRNA PlncRNA-1靶向miR-146a/TGF-β1轴参与类风湿性关节炎发生发展机制研究》文中提出研究目的:类风湿性关节炎是一种常见的对称性多关节炎为主要临床表现的自身免疫性疾病,类风湿性关节炎的病因及发病机制较为复杂,目前尚不清楚。近些年来研究证实非编码RNA通过靶向下游相关基因参与到类风湿性关节炎发生及发展过程中。基于此,本论文从以下三个方面展开讨论:从临床研究角度探究Lnc RNA Plnc RNA-1、mi R-146a及TGF-β1对类风湿性关节炎患者病情严重程度的评估价值。从细胞学的角度探究Lnc RNA Plnc RNA-1、mi R-146a/TGF-β1轴之间的靶向关系,并且探究三者调控滑膜成纤维细胞增殖、迁移、侵袭性能研究,为临床探究类风湿性关节炎病理机制提供理论基础。从体内动物模型探究Lnc RNA Plnc RNA-1、mi R-146a、TGF-β1因子参与类风湿性关节炎发生及发展的机理,确定Lnc RNA Plnc RNA-1、mi R-146a、TGF-β1对其大鼠体内炎性因子的调控行为。方法:（1）选取30只Wistar雌性大鼠,构建II型胶原诱导型关节炎CIA大鼠模型,设置Control组、Model组;确定模型建立成功性;RT-PCR检测各组大鼠关节滑液及滑膜组织内Lnc RNA Plnc RNA-1、mi R-146a及TGF-β1浓度表达;ELISA检测大鼠关节滑液及滑膜组织内炎性因子浓度表达;TUNEL法检测滑膜组织细胞凋亡指数;确定滑膜组织内Lnc RNA Plnc RNA-1、mi R-146a及TGF-β1表达与炎性因子及凋亡指数之间的相关性。（2）临床研究:选取在我院确诊的70例类风湿性关节炎患者,根据是否处于活动期分为活动期RA（n=34）和非活动期RA（n=36）两组患者,选择同期40例健康体检人员作为对照组;RT-PCR检测血清内Lnc RNA Plnc RNA-1、mi R-146a及TGF-β1浓度表达;ELISA检测血清内CRP、ESR、INF-γ、TNF-α、IL-17及IL-10因子表达浓度;Lnc RNA Plnc RNA-1、mi R-146a及TGF-β1表达与因子CRP、ESR、INF-γ、TNF-α、IL-17及IL-10之间的相关性;受试者血清内Lnc RNA Plnc RNA-1与mi R-146a、mi R-146a与TGF-β1及Lnc RNA Plnc RNA-1与TGF-β1三组浓度表达之间的相关性;ROC曲线分析Lnc RNA Plnc RNA-1对活动期RA的诊断价值。（3）体外细胞研究:选取滑膜成纤维细胞（RA-FLS）作为研究对象,原代培养,选取P3细胞作为研究对象;细胞经LPS处理后分别转染Lnc RNA Plnc RNA-1、mi R-146a及TGF-β1过表达及敲除质粒,设置Control组、pc DNA-Plnc RNA-1、si Plnc RNA-1、pc DNA-mi R-146a、pc DNA-Plnc RNA-1+mi R-146a及pc DNAPlnc RNA-1+mi R-146a+TGF-β1组,细胞继续培养48小时;RT-PCR确定各组细胞内Lnc RNA Plnc RNA-1、mi R-146a及TGF-β1转染成功性;双荧光素酶基因法确定Lnc RNA Plnc RNA-1、mi R-146a及TGF-β1三者之间的靶向调控性;CCK-8检测细胞增殖活性;Annexin V法检测各组细胞凋亡能力;ELISA检测炎症因子INF-γ、TNF-α、IL-17及IL-10的浓度表达;划痕实验及Transwell实验确定细胞的迁移及侵袭情况;WB检测迁移侵袭及细胞增殖相关蛋白的浓度表达。结果:（1）模型建立成功性验证:三周后模型组大鼠模型建立后第四周,模型组大鼠关节表面皮肤充血粉红发亮;对照组大鼠的关节无明显的红肿现象,活动正常;3周及4周对照组大鼠体重增加快于模型组;模型组大鼠后足容积逐渐增加,在模型建立后2周、3周及4周（P<0.05）;随着时间的延长,模型组大鼠关节炎指数增加（P<0.05）;病理形态分析对照组大鼠关节面较为光滑,滑膜薄而完整,无明显的组织水肿以及炎性细胞浸润现象;CIA模型大鼠关节腔内滑膜组织有炎性细胞的浸润现象,滑膜细胞增生排列较为紊乱,部分滑膜出现缺失;CIA模型建立后大鼠关节滑液及滑膜组织内Lnc RNA Plnc RNA-1及TGF-β1表达降低,mi R-146a的表达提升（P<0.05）;CIA模型建立后,滑膜组织细胞的凋亡性提升（P<0.05）。CIA模型建立后,大鼠关节滑液以及滑膜组织内炎症因子INF-γ、TNF-α、IL-17的浓度表达增加,IL-10的浓度表达降低（P<0.05）;Lnc RNA Plnc RNA-1、TGF-β1的表达与INF-γ、TNF-α、IL-17的表达体现出负相关性,与IL-10的表达体现出正相关性;mi R-146a的表达与INF-γ、TNF-α、IL-17的表达体现出正相关性,与IL-10的浓度表达体现出负相关性（P<0.05）。（2）临床研究:一般资料:三组受试者的平均年龄、性别比例、病程、BMI指数、基础性疾病（高血压、冠心病、糖尿病）无差异,（P>0.05）;血清及细胞样品内Lnc RNA Plnc RNA-1、mi R-146a及TGF-β1浓度表达趋势相同,RA患者中Lnc RNA Plnc RNA-1、TGF-β1低表达,mi R-146高表达,活动期患者趋势最明显,非活动期次之,对照组最后（P<0.05）;RA患者血清内CRP、ESR、INF-γ、TNF-α、IL-17的表达高于对照组,IL-10浓度表达低于对照组,活动期RA患者炎性因子表达浓度最高（P<0.05）;活动期RA患者血清内Lnc RNA Plnc RNA-1、TGF-β1表达与CRP、ESR、INF-γ、TNF-α、IL-17负相关性明显,与IL-10正相关性,mi R-146体现出相反趋势（P<0.05）;活动期RA血清内Lnc RNA Plnc RNA-1与mi R-146a、Lnc RNA Plnc RNA-1与TGF-β1以及mi R-146a与TGF-β1之间分别体现出负相关性、正相关性、负相关性,其中活动期RA患者相关性最强,非活动期RA患者次之,对照组三者无相关性（P<0.05）;活动期患者、非活动期患者、健康对照组三者的AUC面积分别为0.8611,0.9004及0.6361,三者的95%CI分别为0.7730～0.9493,0.8279～0.9729及0.5263～0.7460,（P<0.05）。（3）Lnc RNA Plnc RNA-1、mi R-146a及TGF-β1质粒在RLS细胞内转染成功,Lnc RNA Plnc RNA-1的过表达可以提升TGF-β1在RLS的表达,抑制mi R-146a表达,（P<0.05）;Lnc RNA Plnc RNA-1的m RNA 3’非编码区预测到一个mi R-146a的结合位点,将野生型和突变型p GL3-Plnc RNA-1-UTR表达载体转染至RLS细胞中,共转染野生型表达载体报告基因活性显着降低（P<0.05）;mi R-146a的m RNA 3’非编码区预测到一个TGF-β1的结合位点,采用共转染技术将不同组合的野生型和突变型p GL3-TGF-β1-1-UTR表达载体得以转染至RLS细胞中,共转染野生型表达载体报告基因活性显着降低（P<0.05）,Target Scan软件分析并未发现Lnc RNA Plnc RNA-1与TGF-β1之间存在一定的结合位点;随着时间的延长,各组RLS细胞均体现出增加的趋势。pc DNA-Plnc RNA-1在RLS细胞内的过表达可以抑制RLS细胞的增殖活性、迁移及侵袭能力及细胞内炎症反应,细胞内Survivin、PCNA、Bcl-2、MMP-2及MMP-9等蛋白浓度均明显降低;促进细胞的凋亡性,Bax及Caspase-3的表达浓度增加(P<0.05。结论:（1）大鼠类风湿性关节炎CIA模型中关节滑液和滑膜组织内Lnc RNA Plnc RNA-1及TGF-β1表达降低,mi R-146a表达提升;Lnc RNA Plnc RNA-1及TGF-β1抑制炎性因子的表达,抑制疾病进展,mi R-146a的表达则提升炎性因子表达,促进类风湿性关节炎的发展。（2）Lnc RNA Plnc RNA-1、mi R-146a及TGF-β1在类风湿关节炎患者血清内存在差异性表达,Lnc RNA Plnc RNA-1、TGF-β1低表达抑制炎症因子浓度表达;mi R-146a高表达促进炎症因子浓度表达;活动期患者Lnc RNA Plnc RNA-1、mi R-146a及TGF-β1三者之间相关性明显,共同调控疾病的发展。（3）Lnc RNA Plnc RNA-1靶向mi R-146a/TGF-β1轴对RLS细胞生物活性产生调控,过表达的Lnc RNA Plnc RNA-1通过抑制mi R-146a的表达和促进TGF-β1因子浓度表达来抑制RLS细胞的增殖活性、迁移及侵袭能力以及炎症反应,促进RLS细胞的凋亡活性,最终抑制类风湿性关节炎的发生及发展过程。
王淼[2]（2021）在《SNX10在小鼠创伤性骨关节炎运动干预中的作用研究》文中研究表明研究背景创伤性骨关节炎（Post-traumatic osteoarthritis,PTOA）主要表现为关节软骨破坏,滑膜炎症,骨赘形成、软骨下骨病理性退变等骨重建变化。适宜强度的运动对关节软骨具有保护作用,但作用机制尚不明确。分选连接蛋白10（Sorting nexin 10,SNX10）基因突变能够调控骨代谢和炎症进程,与PTOA的基础病理存在潜在联系。研究目的本团队前期预实验发现,大强度运动过程中SNX10在软骨中基因表达上调,推测其参与调控软骨细胞的功能。本研究利用基因敲除技术,在动物实验与细胞分子水平系统地研究了SNX10在PTOA小鼠运动干预中的作用,揭示SNX10在软骨细胞功能调控中的重要性,为PTOA的运动干预提供了理论依据。研究方法第一部分运动对创伤性骨关节炎小鼠膝关节软骨SNX10的影响1.45只20周龄野生型雄性小鼠随机分为5组:模型对照组（Nor,n=9）、模型组（Mod,n=9）、对照组（Con,n=9）、模型静养组（Res,n=9）、模型康复组（Rh,n=9）。2.Nor和Con组小鼠不进行运动干预。Mod、Res、Rh组小鼠进行为期5周大强度跑台运动,跑台坡度5°,最大速度20 m/min,5天/周,造成PTOA动物模型。Rh组小鼠造模结束后,休息1周后进行为期4周的小强度跑台运动干预,坡度0°,匀速8m/min,5天/周。Res组小鼠造模后开始5周静养。3.每周记录小鼠体重。Nor、Mod组小鼠在实验第5周结束时处死,Con、Res、Rh组小鼠在实验第10周结束时处死,并取小鼠双侧后肢膝关节组织和眼球血清。Micro-CT检测相关骨质参数;石蜡切片进行HE染色检测Mankin’s评分,番红固绿染色检测OARSI评分;RT-qPCR检测软骨组织中SNX10、MMP9、β-catenin、COL-Ⅱ、ADAMTS-5、TNF-α、IL-1βm RNA表达水平;ELISA检测血清中IL-6、TNF-α、GAG的含量;Western-blot检测SNX10、MMP9蛋白表达变化。第二部分SNX10缺失在创伤性骨关节炎小鼠膝关节软骨损伤中的作用1.遗传背景为C57BL/6雄性小鼠。18只Snx10-/-小鼠随机分为2组:模型对照组（KO-Nor,n=9）、模型组（KO-Mod,n=9）;18只同窝Snx10+/+小鼠随机分为2组:模型对照组（WT-Nor,n=9）、模型组（WT-Mod,n=9）。2.KO-Nor和WT-Nor组小鼠不进行运动干预;KO-Mod和WT-Mod PTOA造模方法同第一部分。3.每周记录小鼠体重。4组小鼠实验第5周结束时处死。取材、Micro-CT、Mankin’s评分、OARSI评分、RT-qPCR、ELISA检测指标同第一部分,RT-qPCR检测SNX10 m RNA;采用Western-blot验证Snx10-/-小鼠建立成功,检测MMP9、β-catenin蛋白表达变化。第三部分机械牵张力刺激下SNX10缺失对软骨细胞修复的作用1.野生型原代软骨细胞,按牵张时长分为4组:正常对照组（CON）,牵张1h组（1H）,牵张2h组（2H）,牵张4h组（4H）。采用0.5Hz、10%强度进行机械牵张力刺激。2.RT-qPCR检测软骨细胞中SNX10、MMP9、β-catenin、COL-Ⅱ、TNF-α、IL-1βm RNA表达水平;（Annexin V-FITC/PI）检测试剂盒检测各组软骨细胞凋亡情况。确定适宜的机械牵张方案。3.检测梯度浓度为2ng/ml、4ng/ml、6ng/ml、8ng/ml、10ng/ml的IL-1β刺激剂对野生型原代软骨细胞活性的影响。4.提取Snx10-/-和同窝Snx10+/+原代软骨细胞。单个基因型分为4组:对照组（CON）,牵张1h组（1H）,IL-1β组（IL-1β）,IL-1β+牵张组（S）,2个基因型共计8组。CON组不进行干预;IL-1β、S组使用IL-1β刺激剂干预;1H组使用0.5Hz、10%强度、1H的机械牵张力刺激,S组在IL-1β刺激剂后使用0.5Hz、10%强度、1H的机械牵张力刺激。5.RT-qPCR检测MMP9、COL-Ⅱ、β-catenin m RNA表达水平;Western-blot和免疫荧光法检测MMP9、COL-Ⅱ、β-catenin蛋白表达变化。研究结果第一部分运动对创伤性骨关节炎小鼠膝关节软骨SNX10的影响1.Mod组和Res组小鼠体重显着下降（P<0.05）。2.Mod组小鼠骨矿物质密度、骨小梁厚度升高（P<0.05）、连接密度下降（P<0.05）;Rh组小鼠骨矿物质密度升高（P<0.05）。3.Mod组和Res组软骨损伤评分（Mankin’s）及钙化评分（OARSI）升高（P<0.05）,Rh组较Res组评分下降（P<0.05）。4.造模后Mod组COL-Ⅱm RNA显着下调（P<0.05）,SNX10、MMP9、β-catenin、ADAMTS-5、TNF-α、IL-1βm RNA显着上调（P<0.05）;与Con组相比Res组ADAMTS-5、IL-1βm RNA显着上调（P<0.05）;与Res组相比Rh组COL-Ⅱm RNA显着上调（P<0.05）,ADAMTS-5、TNF-α、IL-1β、β-catenin、MMP9、SNX10 m RNA显着下调（P<0.05）。5.与Nor组和Con组对比,Mod组和Res组血清中的IL-6、TNF-α含量均显着上调（P<0.001）,GAG含量显着下调（P<0.001）;与Res组相比,Rh组IL-6、TNF-α含量均显着下调（P<0.001）,GAG含量显着上调（P<0.001）。6.与Con组对比,Res组SNX10蛋白表达显着上调（P<0.05）;与Res组相比,Rh组SNX10和MMP9的蛋白表达显着下调（P<0.05）。第二部分SNX10缺失在创伤性骨关节炎小鼠膝关节软骨损伤中的作用1.与KO-Nor组相比,KO-Mod组小鼠体重在3-5周显着下降（P<0.05）。KO-Mod组小鼠在第5周体重大于WT-Mod小鼠（P<0.05）。2.与其他对应的组别相比,KO-Mod组小鼠骨矿物质密度、连接密度、骨小梁厚度显着升高（P<0.05）。3.KO小鼠与WT小鼠比较,造模前后的软骨损伤评分降低（P<0.05）。4.与WT-Mod组相比,KO-Mod组COL-Ⅱm RNA显着上调（P<0.05）,ADAMTS-5、TNF-α、IL-1β、MMP9、β-catenin m RNA显着下调（P<0.05）。5.与WT-Mod组相比,KO-Mod组血清中的IL-6、TNF-α含量均显着下降（P<0.001）,GAG含量显着上升（P<0.001）。6.Western-blot结果显示,Snx10-/-全基因敲除型小鼠建立成功;基因敲除可以显着下调造模前后MMP9、β-catenin蛋白表达（P<0.05）。第三部分机械牵张力刺激下SNX10缺失对软骨细胞修复的作用1.1H的机械牵张可以显着下调软骨细胞β-catenin、TNF-α、IL-1βm RNA水平（P<0.01）,显着上调COL-Ⅱm RNA（P<0.05）,2H、4H组显着上调SNX10、TNF-α、β-catenin m RNA（P<0.01）、COL-Ⅱm RNA显着下调（P<0.01）。2.1H组细胞凋亡情况较轻,4H组细胞凋亡情况显着。3.10ng/ml浓度的IL-1β能够明显降低软骨细胞活性。4.IL-1β刺激剂可显着上调MMP9、β-catenin m RNA（P<0.05）,显着下调COL-Ⅱm RNA（P<0.05）;结合1H机械牵张,KO组比WT组下调MMP9、β-catenin m RNA的效果更显着（P<0.01）,COL-Ⅱm RNA显着上调（P<0.05）。5.IL-1β刺激剂可显着下调COL-Ⅱ的蛋白表达（P<0.05）,显着上调MMP9、β-catenin的蛋白表达（P<0.05）;机械牵张对IL-1β刺激剂诱导两种基因型的软骨细胞COL-Ⅱ、MMP9、β-catenin的蛋白表达具有调节作用;基因敲除结合机械牵张显着下调了MMP9的蛋白表达显着下降（P<0.05）。研究结论1.小强度跑台对小鼠创伤性骨关节炎模型软骨组织具有调控作用。2.SNX10基因缺失缓解了小鼠PTOA进程中软骨组织的损伤程度。3.SNX10基因缺失与适宜的机械牵张力刺激调控软骨细胞炎症因子、合成与降解因子的表达,从而保护PTOA中的软骨细胞。4.适宜强度的运动和机械牵张力刺激通过SNX10介导MMP9、β-catenin促进软骨组织修复。
李兆东[3]（2021）在《万通筋骨片对类风湿关节炎的抗炎机制研究及16S rDNA高通量测序和代谢组学分析》文中研究指明类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种慢性自身免疫性疾病,具有致残率高,治疗周期长,预后差和易复发等特点,常给患者家属和社会带来沉重负担。成纤维样滑膜细胞（rheumatoid arthritis-fibroblast-like synoviocytes,RAFLSs）是关节滑膜组织的重要组成细胞,其过度增殖可促进免疫细胞释放大量促炎因子,从而引发炎症反应,加剧RA病理进程。此外,关节腔内募集的促炎因子也会进一步激活RA-FLSs细胞。因此,抑制RA-FLSs细胞增殖或降低关节内促炎因子水平是治疗RA的一种有效手段。当前,药物治疗仍是RA的主要治疗方式,但由于化学合成药物的治疗不仅费用昂贵,且常伴有副作用,因此人们正积极寻找安全、有效和廉价的药物来治疗RA。近年来,中药以其具有的显着疗效和较少的副作用,在治疗RA方面已受到越来越多的关注。此外,中药可通过多成分、多途径、多靶点的方式参与RA的治疗过程。万通筋骨片是由25味中药组成的复方药,具有“祛风散寒、通络止痛”的功效,主要用于风湿和类风湿性关节炎等骨性疾病。由于其作用机理不明确,从而限制了它在国内外的推广和使用。因此,系统研究万通筋骨片在治疗RA中的作用和机制十分必要。首先,基于胶原诱导性关节炎（collagen-induced rheumatoid arthritis,CIA）大鼠模型,我们研究万通筋骨片对RA的抗炎作用;其次,基于RA-FLSs细胞的生物学活性,我们研究万通筋骨片对RA的抗炎机制;随后,在万通筋骨片抗炎作用的基础上,我们利用高通量测序技术继续挖掘万通筋骨片的抗炎基因靶点;最后,我们利用16S rDNA高通量测序和代谢组学分析研究万通筋骨片对肠道菌群和血清代谢物谱的影响,拟挖掘参与万通筋骨片抗炎作用的靶点微生物群和靶点代谢物。因此,本研究不仅为万通筋骨片在临床上治疗RA提供了实验依据,促进了其推广和应用,而且也为中药治疗RA的机制研究建立了新的思路。第一部分万通筋骨片对类风湿关节炎的抗炎作用首先,为了确定万通筋骨片的安全给药浓度,我们进行了急性毒性实验,血常规检测和肝脾肾功能分析。其次,为了评估CIA大鼠模型的构建效果,我们检测了大鼠的足趾肿胀度,关节内TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子水平,关节的病理结构变化,以及滑膜组织中FLSs特异性标志蛋白（Vimentin）的表达水平。最后,为了研究万通筋骨片对RA的抗炎作用,我们连续灌胃给药14天和28天后,检测了CIA大鼠足趾肿胀度,炎性关节病理结构变化,以及关节腔和关节组织中TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子水平。结果显示:万通筋骨片给药的安全有效浓度可设为150、300和600 mg/kg;CIA大鼠成模率>99.00%。当连续治疗14天时,各组CIA大鼠足趾肿胀度没有明显变化;当连续治疗28天时,300和600 mg/kg组的CIA大鼠足趾肿胀度明显降低。组织病理切片显示,连续给药14天和28天时,各组CIA大鼠的关节病理结构发生不同程度的改善,尤以600 mg/kg连续给药28天的治疗组CIA大鼠,病理结构改善效果最佳。关节腔内促炎因子的水平变化结果显示,在连续给药14天和28天时,各给药浓度均表现出不同程度的抗炎作用,尤以600 mg/kg连续给药28天的抗炎效果最佳。关节组织中促炎因子的水平变化结果显示,连续给药14天时,TNF-α和IL-1β促炎因子水平显着降低;连续给药28天时,TNF-α,IL-1β和IL-6促炎因子水平明显下调。这些结果说明,万通筋骨片对RA具有抗炎作用,且呈现一定的时间依赖性和浓度依赖性。第二部分万通筋骨片在类风湿关节炎中的抗炎机制基于万通筋骨片的抗炎作用,本研究在细胞水平和动物水平继续研究万通筋骨片的抗炎机制。首先,为了确定万通筋骨片对RA-FLSs细胞增殖的影响,我们观察了RA-FLSs细胞形态变化,并应用乳酸脱氢酶活性测定,Ed U核酸标记以及免疫组化等实验技术检测RA-FLSs细胞数目变化和滑膜组织中Vimentin蛋白表达情况。其次,我们利用蛋白免疫印迹,免疫荧光和免疫组化等技术检测了MEK、p MEK、ERK1/2和p ERK1/2蛋白在RA-FLSs细胞及CIA大鼠滑膜组织中的表达水平。同时,我们还利用ERK1/2质粒转染等相关实验,进一步验证MEK/ERK信号通路在万通筋骨片抗炎过程的作用。最后,为了研究万通筋骨片是否通过诱导滑膜细胞凋亡的方式参与抗炎作用,我们检测了RA-FLSs细胞中caspase-3/9蛋白酶活性,cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的蛋白表达水平,以及CIA大鼠滑膜组织中Bax,Bcl-2,caspase-3和cleaved-caspase-3蛋白表达水平。结果显示:药物处理24 h和48 h后,各组RA-FLSs细胞形态均发生改变,尤以3 mg/ml和4 mg/ml药物浓度处理48 h,细胞形态变化较为明显。药物处理24 h后,各组RA-FLSs细胞数目无明显变化;药物处理48 h后,2 mg/ml、3mg/ml、4 mg/ml给药浓度可以显着抑制RA-FLSs细胞增殖。经药物处理24 h和48 h后,MEK,p MEK,ERK1/2和p ERK1/2蛋白在RA-FLSs细胞中均呈现不同程度的降低趋势,尤以3 mg/ml和4 mg/ml药物浓度处理48 h,各蛋白表达差异最为明显。同时,过表达ERK1/2显着提升RA-FLSs细胞的增殖能力,而过表达ERK1/2的RA-FLSs细胞经3 mg/ml药物浓度处理后,细胞增值能力显着下降。同时,万通筋骨片可以下调MEK,p MEK,ERK1/2和p ERK1/2蛋白在滑膜组织中的表达。此外,药物处理24 h后,4 mg/ml药物浓度显着提高RA-FLSs细胞中caspase-3/9蛋白酶活性;药物处理48 h后,3 mg/ml和4 mg/ml明显上调caspase-3/9蛋白酶活性。我们还发现,药物处理24 h和48 h后,3 mg/ml和4mg/ml药物浓度显着上调cleaved-caspase-3蛋白表达,2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml药物浓度显着上调cleaved-PARP蛋白表达。同时,万通筋骨片可以上调滑膜组织中Bax和cleaved-caspase-3蛋白表达以及下调Bcl-2和caspase-3蛋白表达。这些结果表明,万通筋骨片通过抑制RA-FLSs细胞增殖及诱导RA-FLSs细胞凋亡参与抗炎过程。第三部分基于RNA高通量测序挖掘万通筋骨片在类风湿关节炎中的抗炎靶点基于万通筋骨片对RA-FLSs细胞的影响,本研究针对药物处理后的RA-FLSs细胞进行RNA高通量测序分析。为了更加全面、准确的获得抗炎靶点,我们采用两种不同的分析方法进行筛选,即DESeq2差异分析以及STEM时间序列和WGCNA权重共表达联合分析。DESeq2差异分析:通过DESeq2差异分析,拟筛选不同组别间的差异基因;针对这些差异基因,我们随后进行功能富集过滤和蛋白互作（protein-protein interaction,PPI）网络分析,并根据PPI网络中节点连接度筛选备用核心基因。STEM时间序列和WGCNA权重共表达联合分析:基于药物处理组和未处理组之间的差异基因,我们拟筛选与时间序列具有相同表达趋势的基因。针对这些基因,我们进一步筛选具有相同表达模式的差异基因。随后通过功能富集过滤,权重共表达网络分析,PPI网络分析,以及节点连接度来筛选备用核心基因。最后,我们利用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹验证备用核心基因的表达模式,以便获得理想的抗炎靶点。结果显示:通过DESeq2差异分析,在不同比较组间,我们共获得184个差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,且这些基因与细胞周期和同源重组等代谢通路密切相关。同时,基于PPI蛋白网络,我们共筛选出4个备选核心基因,即BRCA1,ATR,SMC3和BUB1。通过STEM时间序列和WGCNA权重共表达联合分析,我们共获得111个具有相同表达趋势和表达模式的DEGs,且这些基因显着富集于细胞周期和RNA转运等代谢通路。同时,基于WGCNA和PPI网络,我们共筛选出6个备选核心基因,即PNN,SMC3,EIF3A,BUB1,ATR和ORC4。此外,TTK,STAG2和THOC1也与细胞周期密切相关,因此TTK,STAG2和THOC1也作为备选核心基因。至此,共获得10个备选核心基因,即:BRCA1、ORC4、TTK、BUB1、SMC3、ATR、PNN、EIF3A、STAG2和THOC1。基因和蛋白验证结果显示,只有SMC3和BUB1的表达模式与测序结果一致。这些结果表明,SMC3和BUB1可能是万通筋骨片在RA中的抗炎靶点。第四部分基于16S高通量测序和代谢组学联合分析挖掘万通筋骨片在类风湿关节炎中的抗炎靶点基于万通筋骨片对CIA大鼠的抗炎作用,本研究针对CIA大鼠粪便样本和血清样本,分别进行16S高通量测序分析和代谢组学分析,拟挖掘万通筋骨片抗炎作用的肠道菌群靶点和代谢物靶点。16S高通量测序分析:基于操作单元聚类和物种多样性分析,我们拟研究万通筋骨片对肠道菌群结构的影响;基于肠道菌群差异分析,我们拟筛选相对丰度较高的差异菌群。代谢组学分析:基于样本相关性和多元统计分析,我们拟研究万通筋骨片对血清代谢物谱的影响;基于差异代谢物筛选,功能富集过滤和差异代谢物表达分析,我们拟筛选理想的差异代谢物。16S高通量测序与代谢组学联合分析:基于top10差异肠道菌属和top20差异代谢物,我们进行联合分析,拟研究肠道微生物群与血清代谢物的关系,并验证或筛选肠道菌群靶点和代谢物靶点。结果显示:通过16S高通量测序分析,我们发现万通筋骨片可以明显改变CIA大鼠的肠道菌群结构。在门水平上,拟杆菌、软壁菌和脱铁杆菌的菌群相对丰度得到显着改善。此外,拟杆菌与厚壁菌的菌群相对丰度比值（Bacteroidetes/Firmicutes）也恢复到正常水平。在属水平上,弧菌、巨型球菌和漫游球菌的菌群相对丰度下调至正常水平。通过代谢组学分析,我们发现万通筋骨片可以明显改变CIA大鼠的血清代谢物谱。其中,血清素、二硫化谷胱甘肽、N-乙酰神经氨酸、萘和血栓素B2等5种代谢物均有标准化的趋势,但不具有统计学差异。通过16S高通量测序与代谢组学联合分析,我们发现,弧菌、巨型球菌和漫游球菌都存在于top10差异肠道菌群范围内,且与这3种微生物群存在显着联系的代谢物包括5种。此外,考虑到代谢物鉴定过程中的假阳性,我们认为:在这5种代谢物中,只有微管素B是内源性代谢物。这些结果表明,万通筋骨片可能通过调节肠道菌群结构和血清代谢物谱发挥抗炎作用,且弧菌、巨型球菌和漫游球菌可能是万通筋骨片的抗炎靶点菌群;微管素B可能是万通筋骨片的抗炎靶点代谢物。
樊哲新[4]（2021）在《乳杆菌和双歧杆菌对类风湿性关节炎的缓解作用及机制研究》文中指出类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）以小关节对称疼痛、软骨和骨侵蚀为特征,是一种系统性自身免疫疾病,发病机制不明确,甲氨喋呤（Methotrexate,MTX）是治疗RA的一线药物。RA常伴随肠道免疫应答失衡,机体免疫耐受破坏,这种变化与肠道菌群失调密切相关。亚临床和早期RA患者肠道中乳杆菌属增加,双歧杆菌属降低。研究已发现补充乳杆菌可降低RA动物系统性炎症,但乳杆菌对肠道微生物及肠道免疫应答的作用不明确;且双歧杆菌作用于RA的研究很少。本研究首先分析短期、低剂量甲氨喋呤治疗后RA患者的肠道菌群特征,尤其是乳杆菌和双歧杆菌的种水平分布;然后利用类风湿性关节炎大鼠筛选具有缓解RA潜力的乳杆菌和双歧杆菌菌种;最后从调节宿主肠道微生物组成和功能、肠道代谢产物以及结肠基因的表达探究乳杆菌和双歧杆菌菌株缓解RA的机制。主要研究结果如下:1.利用高通量测序及GC-MS技术,分析甲氨喋呤治疗的RA患者（MTX-RA）与健康人群（Healthy Controls,HCs）的肠道微生物和短链脂肪酸差异。与HCs相比,MTX-RA肠道微生物组成改变,双歧杆菌属和瘤胃球菌属显着升高,Dorea和Erysipelotrichaceae＿unclassified属相对丰度显着降低;且德氏乳杆菌、肠乳杆菌和Lactobacillus manibotivorans丰度降低。MTX-RA的粪便乙酸、丙酸、丁酸和戊酸分别是HCs组的1.038、1.16、0.93和1.09倍,无显着差异。此外,低剂量、非长期服用甲氨喋呤不影响RA患者肠道微生物多样性及短链脂肪酸的含量。2.应用牛Ⅱ型胶原诱导大鼠出现类风湿性关节炎（Collagen-induced Arthritis,CIA）,比较干酪乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌和罗伊氏乳杆菌6种乳杆菌对大鼠CIA的作用效果,筛选有效乳杆菌菌种。六种乳杆菌均可降低血清自身抗体和促炎因子水平。干酪乳杆菌抑制Th1细胞相关免疫因子,减少细胞浸润和滑膜增生,显着抑制关节炎症和肿胀。罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌分别降低Th1和Th17细胞相关免疫因子,植物乳杆菌对二者均有抑制作用,这三种乳杆菌可减少CIA大鼠的滑膜组织损伤,但对关节肿胀无明显缓解作用;唾液乳杆菌对Th1和Th17细胞相关免疫因子无效,不可缓解关节炎症和肿胀。此外,六种乳杆菌不影响CIA大鼠肠道菌群多样性而影响肠道微生物组成。因此,不同乳杆菌缓解CIA表现出种间差异性,干酪乳杆菌表现最佳的缓解效果。3.比较短双歧杆菌、青春双歧杆菌和两歧双歧杆菌对大鼠CIA的缓解作用,以关节炎表型和关节病理为指标筛选有效双歧杆菌,同时探究双歧杆菌对CIA大鼠血清细胞因子和抗体、肠道Treg细胞、回肠紧密连接基因表达、肠道微生物及短链脂肪酸的影响。三种双歧杆菌均可降低自身抗体水平。短双歧杆菌显着抑制滑膜炎症和关节肿胀、显着降低促炎因子、提高Treg比例和紧密连接基因表达;青春双歧杆菌表现出一定的缓解关节炎作用,仅显着降低TNFα和促进紧密连接基因表达;两歧双歧杆菌无缓解CIA的作用。三种双歧杆菌不影响CIA大鼠肠道菌群的多样性,但均可抑制有害菌Alistipes增加。短双歧杆菌增加肠道SCFAs含量。因此,不同种双歧杆菌对CIA大鼠免疫应答、肠道屏障及肠道微生物表现种间差异,短双歧杆菌缓解CIA效果最佳。4.比较三株干酪乳杆菌和五株短双歧杆菌对CIA大鼠的缓解效果。其中,干酪乳杆菌CCFM1074和短双歧杆菌CCFM1078有效减轻滑膜炎症、关节肿胀和关节侵蚀,均可降低自身抗体和IL-1β,提高Treg细胞比例。干酪乳杆菌CCFM1074和短双歧杆菌CCFM1078影响肠道菌群结构和组成,二者均抑制有害菌Alistipes增加;短双歧杆菌CCFM1078可促进有益菌Turcibacter、Parasutterella和Erysipelotrichaceae恢复,表明干酪乳杆菌CCFM1074和双歧杆菌CCFM1078缓解CIA与调节肠道微生物密切相关。5.探究干酪乳杆菌CCFM1074和短双歧杆菌CCFM1078缓解CIA的潜在机制,利用宏基因组和非靶向代谢组技术分析肠道微生物功能和代谢产物,以及转录组技术解析结肠处的基因表达和功能。干酪乳杆菌CCFM1074和短双歧杆菌CCFM1078均调节肠道微生物组成和功能,均显着下调与脂肪酸代谢、氨基苯甲酸盐降解、酮体合成与降解、苯乙烯降解和二甲苯降解相关的肠道菌群的功能基因表达。差异代谢物KEGG富集分析显示,干酪乳杆菌CCFM1074显着影响酰胺t RNA生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢通路,短双歧杆菌CCFM1078则显着调节维生素B6代谢和和酰胺t RNA生物合成。短双歧杆菌CCFM1078的差异表达基因参与免疫系统通路,而干酪乳杆菌CCFM1074的差异表达基因没有富集到任何通路。
谢坤铭[5]（2021）在《膝骨关节炎患者肠道菌群与代谢变化及桂皮醛对兔膝骨关节炎模型肠道菌群及巨噬细胞极化影响的研究》文中认为膝骨关节炎（Knee Osteoarthritis,KOA）是一种常见于中老年人的退行性疾病,以膝关节软骨退变、关节边缘骨赘形成、周围软组织无菌性炎症以及继发的软骨下骨破坏为主要病理表现。其症状表现以膝关节进行性疼痛、肿胀、活动不利、关节绞索以及关节畸形等为主,严重者还可致残。我国成人KOA总患病率约为15%,大于60岁者达50%,且与性别关系密切,女性则从8.8%逐渐增加到42.7%。中医学认为KOA发病以肝肾亏损、气血亏虚为本,风寒湿邪侵袭为标,应归属于“骨痹”“筋痹”“痛痹”的范畴。桂枝加芍药汤、桂枝芍药知母汤等温经通脉、活血通络,对治疗OA均有良好疗效,且大大降低了口服西药产生的副作用。其君药桂枝的主要有效成分桂皮醛具有抗炎、抗菌、抗氧化,缓解滑膜及软骨细胞的炎症、保护软骨的作用。目前KOA的治疗方法中,除了手术、微创等治疗,患者需要长期口服非甾体抗炎药缓解疼痛,长期的服药给患者的胃肠及肝肾功能造成了程度不一的副作用,损害了患者的整体机能,许多患者因此无法继续服药,只能忍受疼痛。研究发现,KOA患者也存在肠道菌群失调症状,且血液及尿液检测氨基酸代谢失调。因此,深入研究KOA患者的肠道菌群状况以及桂皮醛在缓解关节炎症的同时,对肠道菌群调节作用,对于降低常规治疗的副作用,稳定患者长期规律治疗,延缓疾病进展,有重要意义。目的:1.研究膝骨关节炎患者肠道菌群与代谢情况,找出差异微生物与代谢产物。2.研究桂皮醛对膝骨关节炎的疗效及对肠道菌群的调节作用。3.初步探索桂皮醛对巨噬细胞极化的影响及其与肠道菌群的相关性。方法:1.临床试验观察KOA患者与正常人之间肠道菌群与代谢产物的差异分别选取KOA患者与正常人的粪便样本,用16s rRNA高通量测序技术及LC-MS非靶代谢组学技术分别检测两组样本的肠道菌群及代谢多样性,找出两组样本的差异微生物及相关代谢产物。2.动物实验研究桂皮醛调节肠道菌群干预KOA的免疫机制用膝关节腔内注射木瓜蛋白酶法建立KOA兔模型,随机分为四组:空白组,实验组,对照组,模型组。实验组予桂皮醛灌胃,对照组予双氯芬酸钠缓释胶囊灌胃,模型组造模后不做任何干预自然饲养,空白组不造模不干预。治疗4周后取材。①取各组兔粪便样本,用16s rRNA高通量测序技术检测肠道菌群的丰度与多样性。②光镜下观察各组兔滑膜组织的病理表现。③用酶联免疫吸附法检测各组兔关节液内的炎性因子含量:TNF-α、IL-12、IL-10。④用免疫组织化学法及Western Blot法检测各组兔滑膜组织中M1和M2巨噬细胞标记物iNOS和Arg-1的表达。⑤用反转录聚合酶链技术检测各组兔关节液内M1和M2巨噬细胞标记物CD11c、CD206的水平。结果:1.临床试验观察KOA患者与正常人之间肠道菌群与代谢的差异1.1肠道菌群检测结果:患者与正常人相比,瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、芽殖菌属（Gemmiger）、放线菌门、放线菌属（Actinomyces）中的在患者组有显着差异;这些微生物可能与关节损伤有关。1.2代谢组学检测结果:经过筛选,3种代谢产物在KOA患者和正常人中有显着差异,分别为异亮-脯（Isoleucine-Proline）、苯丙-缬（Phenylalanine-Valine）、苯丙-异亮（Phenylalanine-Isoleucine）二肽化合物。2.体内实验研究桂皮醛对兔KOA的疗效及对肠道菌群的调节作用和巨噬细胞极化的影响。2.1酶联免疫吸附实验表明:桂皮醛和双氯芬酸钠均能够降低兔膝关节液内促炎因子TNF-α、IL-12水平,但二者的效果相比,差异不显着;二者均能提高抗炎因子IL-10水平,但差异不显着。说明桂皮醛和双氯芬酸钠均有缓解关节滑膜炎症的作用,二者的疗效相似。2.2免疫组织化学法实验证明:桂皮醛能够降低M1型巨噬细胞标记物iNOS的平均光密度值,提高M2型巨噬细胞标记物Arg-1的光密度值,促进M1型巨噬细胞向M2型极化。且桂皮醛调节M1/M2型巨噬细胞极化的作用强于对照组,二者差异有统计学意义。2.3 Western Blot法实验证明:桂皮醛能够降低M1型巨噬细胞标记物iNOS的表达,提高M2型巨噬细胞标记物Arg-1的表达,促进M1型巨噬细胞向M2型极化。且桂皮醛调节M1/M2型巨噬细胞极化的作用强于对照组,二者差异有统计学意义。2.4 RT-PCR实验证明:桂皮醛能够下调M1型巨噬细胞标记物CD11c基因的水平,上调M2型巨噬细胞标记物CD206基因的水平,促进M1型巨噬细胞向M2型极化。且对照组双氯芬酸钠对CD11c和CD206基因的表达无明显差异,巨噬细胞的极化作用不明显。2.5肠道菌群检测结果:①各组肠道菌群的多样性比较中,正常组>实验组>对照组>模型组,且各组存在组间差异性。②与空白组相比,模型组的Chloroplast、木霉菌目（Streptophyta）、丁酸单胞菌（Butyricimonas）、丛毛单胞菌科（Comamonadaceae）、臭菌科（Odoribacteraceae）的丰度升高,说明关节炎的发病与上述菌种丰度的增高有关;③与模型组相比,实验组的韦荣氏菌科（Veillonellaceae）、考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）、消化球菌科（Peptococcaceae）丰度升高,提示桂皮醛可以通过稳定上述菌群的丰度缓解关节炎症;④相对于模型组,实验组和空白组均显示出韦荣氏球菌科（Veillonellaceae）、考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）丰度的升高,说明桂皮醛可恢复模型组肠道菌群状态近似于正常的水平,且韦荣氏菌科、考拉杆菌属可被认为是模型组菌群从失调到好转的标志性微生物。⑤拟杆菌门和厚壁菌门与巨噬细胞标志物和炎性因子具有相关性,说明二者的在一定程度上也参与了巨噬细胞极化。结论:1.膝骨关节炎患者的肠道菌群和其代谢物与正常人相比,存在显着差异,Chloroplast、木霉菌目、丛毛单胞菌科、臭杆菌科、丁酸单胞菌丰度及其代谢产物异亮-脯（Isoleucine-Proline）、苯丙—缬（Phenylalanine-Valine）、苯丙-异亮（Phenylalanine-Isoleucine）二肽化合物的增高可能与膝关节的发病有关。2、膝骨关节炎的发病,是糖代谢、脂代谢和免疫调节共同参与的结果,可能与肠道菌群及其代谢物产生的短链脂肪酸过量有关。3.桂皮醛可通过稳定兔肠道中的韦荣氏球菌科、考拉杆菌属、消化球菌科,调节M1/M2巨噬细胞极化,缓解关节滑膜组织的炎症,恢复兔KOA模型肠道菌群接近正常状态。
范氏绒[6]（2021）在《昆断益母方调控Treg/Th17细胞失衡和抗类风湿关节炎的机制研究》文中认为目的:类风湿关节炎是一种以影响关节和软骨的慢性炎症为特征的自身免疫性疾病,可导致不同程度的关节疼痛、僵硬、肿胀和畸形,并可引起不同程度的残疾。目前治疗类风湿关节炎的主要目的是缓解疼痛和炎症,减少关节损伤和残疾,维持或改善身体机能,保证正常的生活质量。中国是中草药大国,中医药治疗类风湿关节炎历史悠久,治疗经验和策略丰富,使中医药在临床治疗类风湿关节炎中广泛应用。在“因地制宜”“辨证论治”理念的指导下,本实验室拟出了昆断益母方这一临床使用有效的复方。实验室前期的研究已经证实昆断益母方对类风湿性关节炎有很好的疗效。作为一名越南医生,已将昆断益母方在越南进行推广,并取得一定的临床成果。但是其治疗类风湿关节的作用机制仍然大量未知。近年来,随着人们对类风湿性关节炎发病机制认识的不断深入,发现辅助性T17细胞（T helper 17,Th17）与调节性T细胞（regulatory T,Treg）之间的功能失衡是引起类风湿性关节炎发病的发病机制之一。因此,本研究利用小鼠类风湿性关节炎的动物模型-胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis,CIA）和体外细胞实验探讨昆断益母方对CIA小鼠和细胞内Th17/Treg失衡、炎症因子以及micro RNAs表达水平调控的作用,为昆断益母方类治疗类风湿性关节炎的作用机制提供新的理论依据。方法:（1）24只SPF级9周龄雄性DBA/1小鼠,采用随机数字表法将小鼠随机分为4组:正常组（Normal）、模型组（Model）、甲氨蝶呤组（MTX）和昆断益母方组（KDYMF）。以正常小鼠作为正常组,以MTX为阳性对照组,确保每组样本量为6只。采用牛II型胶原（collagen II,CII）免疫小鼠,诱导发生关节炎。自初次免疫后第21天（即第二次加强免疫当天,也就是造模完成当天）开始,给予相应的处理,昆断益母方（KDYMF）（0.2 m L/10g）,每天灌胃1次,连续2周;甲氨蝶呤（MTX）组,给予2 mg/kg,每周灌胃2次,连续2周;正常对照组给予等体积生理盐水,每天灌胃1次,连续2周后。每2天观察四肢临床评分,第35天予小鼠脱颈椎处死。在第35天取小鼠血液、脾脏、关节滑膜及软骨组织。HE染色检测踝关节组织病理学改变。（2）采用RT-qPCR方法检测第35天时外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）和关节滑膜组织中Treg细胞的特异性转录因子-特异性转录因子叉头蛋白p3（forkhead box p3,Foxp3）和Th17细胞的特异性转录因子-维甲酸相关孤儿受体γt（retinoid-related orphan nuclear receptor,RORγt）的m RNA表达水平;血清、关节滑膜组织和关节软骨组织中的Toll样受体4（Toll-like receptors 4,TLR4）和信号传导及转录激活因子3（signal transducers and activators of transcription,STAT3）m RNA表达水平;血清和关节滑膜组织中miR-21-5p表达水平。ELISA方法测定第35天时PBMC中白介素（interleukin,IL）-1β（IL-1β）、IL-17、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、IL-10的表达水平。（3）分离小鼠脾脏初始T细胞,置于IL-6（30 ng/m L）的极化环境进行培养,然后对细胞进行昆断益母方（KDYMF,600μg/m L）干预,实验分为4组,分别为对照组（Control）、昆断益母方组（KDYMF）、IL-6组（IL-6）、IL-6+昆断益母方组（IL-6+KDYMF）。培养48h后,RT-q PCR检测各组细胞中IL-17,IL-1β,TNF-α,IL-10的表达。随后对各组细胞给予anti-CD4抗体（2μg/m L）和anti-CD25抗体（2μg/m L）激活,流式细胞仪检测分析Th17和Treg细胞的比例。（4）小鼠原始T细胞,添加IL-6（30 ng/m L）同小鼠成纤维细胞样滑膜细胞同时极化培养,然后对细胞进行昆断益母方（KDYMF,600μg/m L）干预,实验分为4组,初始T细胞+滑膜细胞组（Control）,初始T细胞+滑膜细胞+昆断益母方组（KDYMF）、初始T细胞+IL-6+滑膜细胞组（IL-6）、初始T细胞+IL-6+滑膜细胞组+昆断益母方组（IL-6+KDYMF）,培养48h后,CCK8方法检测滑膜细胞的增殖;培养48h后,Transwell检测滑膜细胞迁移和侵袭;RT-q PCR检测各组滑膜细胞中miR-21-5p表达水平,以及Foxp3和RORγt的m RNA表达水平。结果:（1）从第25天开始,模型组（Model组）小鼠双侧的踝关节出现明显的类风湿性关节炎临床症状,在第35天时大部分小鼠表现踝关节强直样改变。甲氨蝶呤灌胃治疗（MTX组）和经过昆断益母方灌胃的治疗（KDYMF组）小鼠踝关节并没有出现明显的红肿,并且关节活动度也与正常小鼠无明显差异。（2）CIA小鼠踝关节组织HE染色病理结果显示,模型组小鼠踝关节结构破坏严重,炎症细胞浸润明显,滑膜增生,导致软骨及骨破坏。DTYMD组及MTX组踝关节相对完整,滑膜增厚不明显,少量炎症细胞浸润。（3）CIA小鼠在免疫的第35天时,与Model组相比,MTX组和KDYMF组小鼠的血液PBMC和关节滑膜组织中Foxp3的m RNA相对表达水平均表现上调,但在KDYMF组小鼠中更显着;而MTX组和KDYMF组小鼠的血液PBMC和关节滑膜组织中RORγt的m RNA相对表达水平均表现下调,在KDYMF组小鼠中更显着。（4）CIA小鼠在免疫的第35天时,与Model组相比,MTX组小鼠的血液PBMC中IL-1β、IL-17、TNF-α表达水平均表现上调,但IL-10表达水平表现出显着下调;KDYMF组小鼠的血液PBMC中IL-1β、IL-17、TNF-α表达水平均低于MTX组,更接近Normal组表达水平;而IL-10表达水平高于MTX组,更接近Normal组表达水平。（5）CIA小鼠在免疫的第35天时,与Model组相比,MTX组和KDYMF组小鼠的血清和关节滑膜组织中miR-21-5p相对表达水平均表现上调,但在KDYMF组小鼠中更显着。（6）CIA小鼠在免疫的第35天时,与Model组相比,MTX组和KDYMF组小鼠的血清、关节滑膜组织和关节软骨组织中TLR4和STAT3的m RNA相对表达水平均表现下调,但在KDYMF组小鼠中更显着,更接近Normal组表达水平。（7）昆断益母方能抑制初始T细胞中炎症因子IL-17、IL-1β和TNF-α表达,但促进IL-10表达。IL-6刺激能促进初始T细胞中炎症因子IL-17、IL-1β和TNF-α表达,但抑制IL-10表达;昆断益母方能降低经IL-6刺激能促进初始T细胞中炎症因子IL-17、IL-1β和TNF-α表达,而上调IL-10表达。（8）昆断益母方能上调初始T细胞分化出来的Treg细胞比例,降低Th17细胞比例。IL-6刺激会明显增加Th17细胞数目,降低Treg细胞数目;但是昆断益母方药能增加Treg细胞比例,下调Th17细胞比例,使Treg细胞和Th17细胞更接近正常水平。（9）昆断益母方能明显抑制正常条件下类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的增殖、迁移和侵袭,同时也能明显抑制T细胞经IL-6刺激后与类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞共培养后细胞的增殖、迁移和侵袭。（10）昆断益母方能明显促进正常条件下类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中miR-21-5p和Foxp3的m RNA的相对表达,降低RORγt的m RNA相对表达水平。同时也能明显上调T细胞经IL-6刺激后与类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞共培养后细胞中miR-21-5p和Foxp3的m RNA的相对表达,降低RORγt的m RNA相对表达水平。结论:（1）CIA模型小鼠体内存在Th17/Treg细胞功能失衡。（2）从CIA小鼠模型和体外细胞模型证实了昆断益母方能够显着提高血清或细胞中IL-10水平,下调IL-1β、IL-17和TNF-α炎症因子水平。（3）从CIA小鼠模型和体外细胞模型证实了昆断益母方能够显着抑制Th17细胞分化,促进Treg细胞生成,改善Treg/Th17失衡状态。（4）昆断益母方能够抑制类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的增殖、迁移和侵袭。（5）昆断益母方能够促进细胞内miR-21-5p的相对表达水平。
周晓红[7]（2021）在《从肝论治针灸对OA模型大鼠软骨损伤的效应机制研究》文中指出目的探讨从肝论治针灸对改良Hulth法制备的内侧间室OA模型大鼠软骨组织的影响,初步阐明从肝论治针灸防治OA模型大鼠软骨组织损伤的效应及昼夜节律作用机制,以期为从肝论治防治OA提供科学实验依据。方法实验一选用30只12周龄SPF级雄性SD大鼠,随机分为模型组、假手术组、正常组,每组10只。模型组,采用改良Hulth法,切开右膝关节前内侧皮肤,钝性分离,暴露股骨内侧髁及关节囊,依次切断内侧副韧带和前交叉韧带,剔除内侧半月板,假手术组仅切开并暴露股骨内侧髁及关节囊,而正常组未予任何手术处理。术后1周,将大鼠放入跑台运动装置每天跑30min,持续3周以复制OA模型。造模术后每周进行旷场实验、足底痛阈测试实验、膝关节活动度等行为学检测,影象学检查右膝关节,关节液中TNF-α、IL-1β含量使用免疫酶联ELISA法检测,软骨损伤情况使用关节标本HE染色及Mankin评分观察,软骨组织中Bmal1、Clock蛋白含量使用免疫荧光法和免疫印迹法检测。实验二将40只12周龄雄性SPF级SD大鼠随机平均分为正常组、从肝论治取穴组、常规取穴组、模型组。其中正常组不做处理,另3组均予造模。治疗从造模手术后4周开始（即跑台3周结束后开始治疗）,共治疗4周。从肝论治取穴组取阳陵泉、肝俞、太冲,常规取穴组取足三里、外膝眼、内膝眼。造模术后每周进行旷场实验、足底痛阈测试实验、膝关节活动度等行为学检测,关节液中IL-1β、TNF-α含量使用免疫酶联ELISA法检测,关节软骨损伤情况使用标本HE染色及Mankin评分观察,软骨组织中Bmal1、Clock蛋白含量使用免疫荧光法和免疫印迹法检测。实验三将50只12周龄雄性SPF级SD大鼠随机平均分为5组。各组处理如下:1)正常组:不手术,不治疗。2)模型组:仅造模,不治疗。3)ERK抑制剂组:造模,手术4周后腹腔注射ERK抑制剂,连续注射28天。4)从肝论治取穴组:造模,手术4周后针灸治疗,从肝论治取穴选取肝俞、太冲、阳陵泉。5)ERK抑制剂+从肝论治取穴组:造模,手术4周后腹腔注射ERK抑制剂,连续注射28天,同时进行针灸治疗,从肝论治取穴选取肝俞、太冲、阳陵泉。治疗结束后,关节标本HE染色及Mankin评分观察软骨损伤情况,免疫酶联ELISA法检测关节液中IL-1β、TNF-α含量,并通过免疫荧光法和免疫印迹法检测软骨组织中Bmal1、Clock、P-ERK、IL-1β、TNF-α蛋白含量。结果实验一1.大鼠术后第1周,与正常组相比,模型组活动总距离、活动速度、机械痛阈值、热痛阈值、关节活动度减小,休息时间延长（P<0.01）,假手术组仅活动速度、机械痛阈值、热痛阈值减小（P<0.01）,而活动总距离、休息时间、关节活动度差异无统计学意义（P>0.05）,与模型组相比,假手术组活动总距离、活动速度、关节活动度增加,休息时间减少（P<0.01）;术后第2-4周,与正常组相比,模型组活动总距离、活动速度、机械痛阈值、热痛阈值、关节活动度减小,休息时间延长（P<0.01）,而假手术组旷场实验、机械痛阈值、热痛阈值、关节活动度差异无统计学意义（P>0.05）。2.大鼠膝关节炎影象学检查显示,正常组和假手术组:右膝关节可见关节间隙存在,且内外侧间隙均匀一致,未见明显骨赘及骨破损。模型组:右膝关节可见关节间隙变窄,且内侧间隙小于外侧,有明显骨赘形成。3.软骨标本HE染色显示,与正常组相比,模型组Markin评分明显升高（P<0.01）,假手术组Markin评分差异无统计学意义（p>0.05）。4.采用免疫酶联ELISA法检测大鼠右膝关节液显示,与正常组相比,假手术组IL-1β、TNF-α的含量差异不明显（P>0.05）,模型组IL-1β、TNF-α的含量明显增多（P<0.01）。5.免疫荧光法和免疫印迹法检测大鼠膝关节软骨组织显示,与正常组相比,模型组Bmal1,Clock蛋白的表达明显下降（P<0.01）,而假手术组Bmal1,Clock蛋白的表达无显着性差异（P>0.05）。实验二1.大鼠术后1周,与正常组相比,其他各组旷场实验、热痛阈值、机械痛阈值、关节活动度有显着性差异（P<0.05）,但造模组间差异无统计学意义（P>0.05）;术后第2-4周,与正常组相比,其他各组大鼠活动总距离、活动速度、热痛阈值、机械痛阈值、关节活动度减小（P<0.05）,休息时间明显延长（P<0.05）,但造模组间差异无统计学意义（P>0.05）;大鼠术后第5-8周,与正常组相比,其他各组活动总距离、活动速度、热痛阈值、机械痛阈值、右膝关节活动度明显降低（P<0.05）,休息时间明显延长（P<0.05）,与模型组相比,常规取穴组和从肝论治取穴组均能提高大鼠活动总距离、热痛阈值、机械痛阈值、右膝关节活动度,并减少休息时间（P<0.05）,且从第6周开始常规取穴组和从肝论治取穴组均能提高大鼠运动速度（P<0.05）,与常规取穴组相比,从肝论治取穴组明能提高大鼠活动总距离、热痛阈值、机械痛阈值、右膝关节活动度,并减少休息时间（P<0.05）,且从第7周开始从肝论治取穴组能明显提高大鼠活动速度（P<0.05）。2.软骨标本HE染色显示,与正常组比,其他各组Markin评分均增高（P<0.01）;与模型组相比,常规取穴组和从肝论治取穴组Marki n评分均明显降低（P<0.01）;与常规取穴组相比,从肝论治取穴组M arkin评分稍低,但差异无统计学意义（P>0.05）。3.采用免疫酶联ELISA法检测大鼠右膝关节液显示,与正常组相比,其他组TNF-α、IL-1β的含量增多（P<0.01）;与模型组相比,常规取穴组和从肝论治取穴组IL-1β、TNF-α的含量明显减少（P<0.05）;与常规取穴组相比,从肝论治取穴组IL-1β、TNF-α的含量更少（P<0.05）。4.免疫荧光法和免疫印迹法检测大鼠关节软骨组织显示,与正常组相比,其他各组Bmal1、Clock蛋白含量均下降（P<0.01）;与模型组相比,常规取穴组和从肝论治取穴组Bmal1、Clock蛋白含量均升高（P<0.01）;与常规取穴组相比,从肝论治取穴组Bmal1、Clock蛋白含量均升高（P<0.05）。实验三1.软骨标本HE染色显示,从Markin评分来看,与正常组比,其他组均明显增高（P<0.001）;与模型组相比,从肝论治取穴组、ERK抑制剂组和ERK抑制剂+从肝论治取穴组均明显降低（P<0.01）;与ERK抑制剂组相比,从肝论治取穴组Markin’s评分差异无统计学意义（p>0.05）,ERK抑制剂+从肝论治取穴组Markin’s评分明显降低（p<0.05）;与从肝论治取穴组相比,ERK抑制剂+从肝论治取穴组Markin’s评分明显降低（p<0.05）。2.采用免疫酶联ELISA法检测大鼠右膝关节液中IL-1β、TNF-α的含量显示,与正常组比,其他组明显升高（P<0.01）;与模型组相比,ERK抑制剂组、从肝论治取穴组和ERK抑制剂+从肝论治取穴组明显减少（P<0.01）;与ERK抑制剂组相比,从肝论治取穴组差异无统计学意义（P>0.05）,ERK抑制剂+从肝论治取穴组IL-1β、TNF-α的含量更少（P<0.05）;与从肝论治取穴组相比,ERK抑制剂+从肝论治取穴组IL-1β、TNF-α的含量更少（P<0.05）。3.免疫荧光法和免疫印迹法检测大鼠关节软骨组织显示,与正常组相比,其他各组Bmal1、Clock蛋白表达量均下降（P<0.05）,P-ERK、IL-1β、TNF-α蛋白表达量明显增多（P<0.05）;与模型组相比,ERK抑制剂组、从肝论治取穴组和ERK抑制剂+从肝论治取穴组大鼠膝关节软骨组织中Bmal1、Clock蛋白表达量均增多（P<0.01）,P-ERK、IL-1β、TNF-α蛋白表达量均明显减少（P<0.01）;与ERK抑制剂组相比,从肝论治取穴组Bmal1、Clock、P-ERK、IL-1β、TNF-α蛋白表达量差异无统计学意义（P>0.05）,ERK抑制剂+从肝论治取穴组Bmal1、Clock蛋白表达量增多（P<0.05）,P-ERK、IL-1β、TNF-α蛋白表达量减少（P<0.05）;与从肝论治取穴组相比,ERK抑制剂+从肝论治取穴组Bmal1、Clock蛋白表达量较高（P<0.05）,P-ERK、IL-1β、TNF-α蛋白表达量明显减少（P<0.05）。结论1.采用改良Hulth法造模可以有效复制内侧间室OA模型,且模型昼夜节律蛋白存在异常。2.从肝论治针灸治疗内侧间室OA效果优于常规取穴针灸。3.从肝论治针灸可以改善内侧间室OA关节功能,修复损伤软骨,可能与昼夜节律蛋白抑制ERK1/2的磷酸化,减少炎症物质产生、减少软骨基质破坏有关。
张译敏[8]（2021）在《壮药龙钻通痹方调控BMP2/Smads信号通路对成骨细胞增殖的影响及其作用机制研究》文中提出目的:本实验在前期实验研究的基础上,通过用甲氨蝶呤及壮药龙钻通痹方低剂量组、壮药龙钻通痹方中剂量组、壮药龙钻通痹方高剂量组制备大鼠含药血清,探讨甲氨蝶呤及壮药龙钻通痹方低、中、高剂量组含药血清对成骨细胞增殖的作用机制以及其对BMP2-Smads信号通路上关键因子基因和蛋白表达的影响,从而探讨壮药龙钻通痹方对骨侵蚀的分子作用机制,为壮药龙钻通痹方治疗类风湿关节炎提供新的理论依据,并指导临床用药。方法:选取健康的雌性SD大鼠40只,适应性喂养1周后,将40只雌性SD大鼠随机分为正常对照组、甲氨蝶呤组、壮药龙钻通痹方低剂量组、壮药龙钻通痹方中剂量组和壮药龙钻通痹方高剂量组。正常对照组每天灌胃等量的生理盐水,壮药龙钻通痹方低剂量组、壮药龙钻通痹方中剂量组、壮药龙钻通痹方高剂量组灌胃剂量分别为1.35、2.7、5.4g·kg-1·d-1,甲氨蝶呤组灌胃剂量为0.9g·Kg-1·d-1。正常对照组、壮药龙钻通痹方低剂量组、壮药龙钻通痹方中剂量组及壮药龙钻通痹方高剂量组于每日上午9点灌胃,每天1次,甲氨蝶呤组每周灌胃2次。连续灌胃15天后,制备正常对照组、甲氨蝶呤及壮药龙钻通痹方低、中、高剂量组含药血清。用制备好的含药血清和MC3T3-E1 subclone 14细胞一起培养。通过MTT实验检测甲氨蝶呤及壮药龙钻通痹方低、中、高剂量组含药血清对MC3T3-E1 subclone 14细胞增殖的影响;通过RT-qPCR检测甲氨蝶呤及壮药龙钻通痹方低、中、高剂量组含药血清对BMP2-SMADs信号通路中关键因子BMP2、Smad1、Smad4、Smad5、Smad9、RUNX2基因表达的影响;通过Western-blot实验考察甲氨蝶呤及壮药龙钻通痹方低、中、高剂量组含药血清对BMP2-SMADs信号通路中关键因子BMP2、Smad1、Smad4、Smad5、Smad9、RUNX2蛋白表达的影响。结果:1.与正常对照组相比,甲氨蝶呤及壮药龙钻通痹方低、中、高剂量组含药血清能够促进MC3T3-E1 subclone 14细胞的增殖,但是没有浓度及时间依赖性。2.与正常对照组相比,壮药龙钻通痹方低、中、高剂量组含药血清均能不同程度的促进MC3T3-E1 subclone 14细胞中BMP2、Smad1、Smad4、Smad5、Smad9、RUNX2基因表达水平。其中,甲氨蝶呤组和壮药龙钻通痹方低、中、高剂量组含药血清均能促进MC3T3-E1 subclone 14细胞中BMP2基因的表达。壮药龙钻通痹方中、高剂量组含药血清能显着的促进MC3T3-E1 subclone 14细胞中BMP2基因的表达（P<0.01）,甲氨蝶呤组和壮药龙钻通痹方低剂量组含药血清能促进MC3T3-E1 subclone14细胞中BMP2基因的表达,且具有统计学差异（P<0.05）。甲氨蝶呤组和壮药龙钻通痹方低、中、高剂量组含药血清均能促进MC3T3-E1subclone 14细胞中Smad4、Smad9基因的表达,其中壮药龙钻通痹方低剂量组含药血清能显着促进MC3T3-E1 subclone 14细胞中Smad4、Smad9基因的表达（P<0.01）,甲氨蝶呤组和壮药龙钻通痹方中、高剂量组含药血清促进MC3T3-E1 subclone 14细胞中Smad4、Smad9基因升高的趋势,但差异不具有统计学意义（P>0.05）。甲氨蝶呤组和壮药龙钻通痹方低、中、高剂量组含药血清有促进MC3T3-E1 subclone 14细胞中Smad1、Smad5相关基因表达升高的趋势,差异不具有统计学意义（P>0.05）。甲氨蝶呤组和壮药龙钻通痹方低、中、高剂量组含药血清均能促进MC3T3-E1 subclone 14细胞中Runx2基因的表达,其中壮药龙钻通痹方低、中、高剂量组含药血清均显着的促进MC3T3-E1 subclone 14细胞中Runx2基因的表达（P<0.01）,甲氨蝶呤组含药血清能促进MC3T3-E1subclone 14细胞中Runx2基因表达升高的趋势,但不具有统计学意义（P>0.05）。3.与正常对照组相比,甲氨蝶呤组和壮药龙钻通痹方低、中、高剂量组含药血清均能不同程度的促进MC3T3-E1 subclone 14中BMP2、Smad1、Smad4、Smad5、Smad9、RUNX2蛋白表达水平。甲氨蝶呤组和壮药龙钻通痹方低、中、高剂量组含药血清可以促进MC3T3-E1 subclone 14中BMP2蛋白的表达,其中,甲氨蝶呤组和壮药龙钻通痹方低剂量组含药血清能促进MC3T3-E1 subclone 14中BMP2蛋白的表达,且具有统计学差异（P<0.05）,壮药龙钻通痹方中剂量组含药血清显着促进MC3T3-E1subclone 14中BMP2蛋白的表达（P<0.01）,壮药龙钻通痹方高剂量组含药血清促进MC3T3-E1 subclone 14中BMP2蛋白表达升高的趋势,但差异不具有统计学意义（P>0.05）。壮药龙钻通痹方中剂量组能促进MC3T3-E1 subclone 14中Smad1蛋白的表达,且具有统计学差异（P<0.05）,甲氨蝶呤组和和壮药龙钻通痹方低,高剂量组促进MC3T3-E1 subclone 14中Smad1蛋白表达升高的趋势,但是不具有统计学差异（P>0.05）。甲氨蝶呤组和壮药龙钻通痹方低、中、高剂量组含药血清可以促进MC3T3-E1 subclone 14细胞中Smad4、Smad5相关蛋白的表达升高的趋势,但不具有统计学意义（P>0.05）。甲氨蝶呤组和壮药龙钻通痹方低、中、高剂量组含药血清可以促进MC3T3-E1 subclone 14中Runx2、Smad9蛋白的表达,其中壮药龙钻通痹方中剂量组能显着的促进MC3T3-E1subclone 14细胞中Runx2、Smad9蛋白的表达（P<0.01）,甲氨蝶呤组和壮药龙钻通痹方低,高剂量组促进MC3T3-E1 subclone 14细胞中Runx2、Smad9蛋白的表达的趋势,但不具有统计学差异（P>0.05）。结论:本实验研究结果表明:1.壮药龙钻通痹方含药血清可以有效促进MC3T3-E1 subclone 14细胞的增殖,但是没有浓度和时间依赖性。2.壮药龙钻通痹方低、中、高剂量组含药血清可以有效促进BMP2-Smads信号通路中关键因子BMP2、Smad4、Smad9、RUNX2等mRNA和BMP2、Smad1、Smad9、Runx2蛋白的表达。说明壮药龙钻通痹方低、中、高剂量组含药血清通过BMP2-Smads信号通路促进成骨细胞的增殖。促进成骨细胞的增殖,从而改善骨侵蚀,可能是壮药龙钻通痹方治疗类风湿关节炎的作用机制之一。
王文娟[9]（2021）在《非变性Ⅱ型胶原蛋白改善骨关节炎的研究进展》文中研究指明随着人口老龄化的到来,骨折和骨关节炎患病人群呈现大幅度增高趋势,严重的危害着老年人的身体健康。作为世界上发病率和致残性都比较高的疾病,关节炎的致残率高达53%。但是关节炎远没有骨质疏松症那样备受重视,尤其是中国,骨关节炎患者数量巨大,目前普遍用于改善关节炎症状的药物有糖皮质激素、非甾体类抗炎药、营养补充剂如硫酸软骨素、氨基葡萄糖、透明质酸等,研究表明药物治疗会带来副作用,而营养补充剂的效果也存在争议。非变性Ⅱ型胶原蛋白（也称之为含Ⅱ型胶原蛋白的软骨粉）在20世纪90年代初开始用于治疗人体的关节炎,效果良好,备受关注。本文主要阐述了非变性Ⅱ性胶原蛋白在改善关节炎方面国内外的动态及前沿研究进展,以及对其作用机制的研究,通过研究发现非变性Ⅱ型胶原蛋白对改善关节炎的症状具有非常重要作用及功能,其具有非常广阔的市场开发前景。
李惠娟[10]（2020）在《针刺内外膝眼治疗KOA临床疗效观察及对KOA模型大鼠NF-κB信号通路水平的影响》文中指出一、目的:针刀和圆利针治疗,均为传统中医外治法,在本试验中,采用了圆利针干预治疗作为对照组,对比针刀治疗的疗效。研究KOA患者肌骨超声的膝周软组织炎症之特点,并进一步探讨针刀治疗KOA的作用机制。本研究团队前期通过动物试验研究表明了 NF-κB炎症通路与滑膜,和软骨组织表达激活,在KOA退变过程中,发挥了重要之调控作用。也通过了临床肌骨超声实验研究,归纳整理总结出KOA软组织炎症表现特性,与中医筋伤理论有相符合。因此在本研究中,我们在前期研究的基础上,基于筋伤理论和解结理论通过开展动物试验,以及临床研究两方面,阐述圆利针治疗对比针刀治疗KOA的作用机制。针刀具备有刀锋,而圆利针不具有。利用此操作方法,相信更能确切,比较出圆利针的“针”与针刀的“刀”的不同差别,并进一步探究针刀治疗,膝骨关节炎的可能机制。二、方法:（一）临床研究方面:采用中华医学会骨科学分会,所制定的《骨关节炎诊治指南》（2018年版）病例筛选标准,纳入收集57位KOA患者,采用关节功能Lysholm评分量表,及膝关节疼痛VAS评分量表,并将患者随机分为针刀实验组和圆利针对照组。针刀试验组采用肌骨超声引导针刀治疗,圆利针对照组则采用肌骨超声引导圆利针治疗,使用与针刀组相同直径的圆利针行针刀手法进行。两组均选取内、外膝眼穴。在安全性方面的差异,及治疗前后症状表现的改善,与KOA症状的相关性方面,对两组患者进行分析观察针刀、圆利针在穿刺治疗过程中,松解的之具体作用。评价膝关节周围软组织炎症之表现,分析膝关节周围软组织炎症表现,应用肌骨超声检查。并从临床角度,探究针刀、圆利针通过松解治疗KOA之具体作用机制。（二）动物试验方面:试验一:选取8周龄的Wistar大鼠40只,并随机分为正常组、造模组、针刀组、圆利针组,每组10只。其中,正常组同期正常饲养,不做任何处理。造模组、针刀组、圆利针组均采用木瓜蛋白酶法造模制造KOA模型之大鼠,造模组不做任何干预治疗,与其他各组同期饲养。针刀组:造模成功后,进行针刀干预,每周一次,共治四周。圆利针组于造模成功后,使用与针刀相同直径的圆利针行针刀手法,每周一次,共治四周。针刀组、圆利针组均选取内、外膝眼穴。各组大鼠于干预治疗结束后取材,取大鼠膝关节软骨、滑膜和髌韧带组织,观察滑膜炎症增生情况。应用Mankin标准评价,各组软骨之破坏程度,软骨组织固定,切片,染色后在光镜下。探究圆利针干预治疗,对比针刀治疗KOA,抑制软骨退变并改善生物力学的作用机制,从组织形态学和及生物力学角度。试验二:KOA大鼠干预,及造模方式同试验一。分别应用蛋白质免疫印迹法（Western blot）,及实时荧光PCR,检测各组大鼠滑膜、软骨组织中NF-κB炎症通路,关键组件NF-κBP65、IKB-α蛋白的表达水平,并应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测,各组大鼠血清中炎性因子TNF-α,IL-1β,MMP-13含量及前列腺素E2,β-内啡肽。应用现代分子生物学技术层面,探究分析圆利针干预,治疗对比针刀治疗KOA之具体作用机制。三、结果:（一）临床研究方面:KOA症状方面,组内比较显示:两组的受试者,在第一次随访和第二次随访时,VAS的疼痛评分及Lysholm的膝关节功能评分,均较治疗前有显着改善（P<0.01）。组间比较显示;针刀试验组在第二次随访时疼痛VAS评分量表改善程度,显着优于圆利针对照组（P<0.05）。并且针刀试验组,在第一次随访时膝关节Lysholm功能评分量表的改善程度,优于圆利针对照组（P<0.05）。在肌骨超声的表现方面:组内比较显示,两组经由治疗后,在滑膜厚度,以及关节积液深度等方面,均较治疗前有显着改善。（二）动物试验方面:试验一:造模完成后,正常组与造模组之评分,比较差异有统计学意义。针刀组、圆利针组和,造模组之间比较差异,无统计学意义,且造模组、针刀组、圆利针组大鼠评分均显着高于正常组,成功模拟了 KOA。各组间Mankin评分均具有统计学差异。针)刀组与圆利针组无统计学差异,造模组、针刀组、圆利针组均显着高于正常组,针刀组、圆利针组均显着低于造模组。就生物力学方面:1、最大应力结果显示,与正常组相比,圆利针组、造模组和针刀组,均有显着降低趋势（P<0.01,P>0.05）;与造模组相比,针刀组、圆利针组有显着升高趋势（P<0.01,P>0.05）;与针刀组相比,圆利针组有降低趋势（P<0.05）。2、最大应变结果显示,与正常组相比,造模组、圆利针组有显着降低趋势（P<0.01,P>0.05）,针刀组有升高趋势（P>0.05）;与造模组相比,针刀组和圆利针组有升高趋势（P<0.05）;与针刀组相比,圆利针组有降低趋势（P>0.05）。3、最大位移结果显示,针刀组、圆利针组、造模组有降低趋势（P<0.05）,与正常组相比;与造模组相比,针刀组、圆利针组有升高趋势（P<0.05,P>0.05）;圆利针组有降低趋势（P>0.05）,与针刀组相比。4、弹性模量结果显示,针刀组、圆利针组、造模组有降低趋势（P<0.05）,与正常组相比;针刀组、圆利针组有显着升高趋势（P<0.01,P<0.05）,与造模组相比;圆利针组有降低趋势（P<0.05）,与针刀组相比。试验二:在滑膜组织中,NF-κB炎症通路关键组件NF-κBP65、IKB-αmRNA和蛋白表达水平,各组均有显着性统计学差异（P<0.01）,针刀组NF-κBp65mRNA和蛋白表达均显着高于圆利针组和造模组（P<0.01）,针刀组IKB-αmRNA和蛋白的表达高于圆利针组和造模组（P<0.05）。针刀组、圆利针血清炎性因子IL-1β、TNF-α、MMP-13、PGE2均显着高于正常组,且针刀组含量显着低于圆利针组,而β-内啡肽试验结果,针刀组显着高于圆利针组。四、结论:（一）通过肌骨超声引导技术,提高了无论是针刀或者圆利针治疗KOA的安全性和疗效。并从临床角度观察圆利针治疗对比针刀治疗如何通过松解,有效治疗KOA的具体作用机制。（二）对比圆利针干预,针刀松解法通过了切割与剥离,能够更有效率的达到松解膝周软组织病灶之黏连与挛缩。在抑制滑膜,软骨形态的破坏,促进动物行为学,与髌韧带生物力学恢复之疗效方面,针刀松解疗法明显优于圆利针干预,从而缓解KOA症状。（三）针刀和圆利针干预治疗,均可通过抑制KOA模型大鼠的之滑膜,及软骨组织中NF-κB信号通路之激活表达。但针刀干预治疗较圆利针干预,更能降低血清中TNF-α,MMP-13,IL-1β含量,及前列腺素E2的含量。并增加β-内啡肽的含量,从而起到抑制关节退变,缓解症状的作用。
二、口服Ⅱ型胶原诱导免疫耐受对大鼠类风湿性关节炎和创伤性骨性关节炎的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、口服Ⅱ型胶原诱导免疫耐受对大鼠类风湿性关节炎和创伤性骨性关节炎的影响（论文提纲范文）
（1）LncRNA PlncRNA-1靶向miR-146a/TGF-β1轴参与类风湿性关节炎发生发展机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 LncRNA PlncRNA-1、miR-146a/TGF-β1轴参与类风湿性关节炎发生发展体内研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验试剂及仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 研究小结 |
| 第二部分 LncRNA PlncRNA-1、miR-146a及TGF-β1对类风湿性关节炎患者病情严重程度的评估价值研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验试剂及仪器 |
| 1.3 相关标准 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 研究小结 |
| 第三部分 LncRNA PlncRNA-1靶向miR-146a/TGF-β1轴参与类风湿性关节炎发生发展机制体外研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验试剂及仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 研究小结 |
| 总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 长链非编码RNA在类风湿性关节炎发生及发展中的应用进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（2）SNX10在小鼠创伤性骨关节炎运动干预中的作用研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 第一部分:运动对创伤性骨关节炎小鼠膝关节软骨SNX10 的影响 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 分析与讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分:SNX10 缺失在创伤性骨关节炎小鼠膝关节软骨损伤中的作用 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 分析与讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分:机械牵张力刺激下SNX10 缺失对软骨细胞修复的作用 |
| 1 前言 |
| 2 实验(一)不同机械牵张时间对软骨细胞SNX10 及相关软骨代谢因子的影响 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 3 实验(二)机械牵张力刺激下SNX10 缺失对软骨细胞修复的作用 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 4 分析与讨论 |
| 5 小结 |
| 全文总结 |
| 1 主要结论 |
| 2 研究意义及创新 |
| 3 研究局限及展望 |
| 正文参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（3）万通筋骨片对类风湿关节炎的抗炎机制研究及16S rDNA高通量测序和代谢组学分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 类风湿关节炎概述 |
| 1.2 类风湿关节炎发病机制 |
| 1.2.1 触发阶段 |
| 1.2.2 成熟阶段 |
| 1.2.3 靶向阶段 |
| 1.2.4 爆发性阶段 |
| 1.3 类风湿性关节炎现代药物疗法 |
| 1.3.1 传统DMARDs |
| 1.3.2 生物DMARDs |
| 1.3.3 小分子DMARDs |
| 1.4 肠道微生物群与类风湿关节炎 |
| 1.4.1 肠道菌群与免疫调节细胞 |
| 1.4.2 肠道菌群介导炎症性关节炎 |
| 1.4.3 肠道菌群介导类风湿关节炎治疗 |
| 1.4.4 益生菌 |
| 1.5 中草药对RA-FLSs细胞凋亡的影响及机制 |
| 1.5.1 RA-FLSs细胞凋亡 |
| 1.5.2 死亡受体介导的凋亡途径 |
| 1.5.3 线粒体依赖性凋亡途径 |
| 1.5.4 .NF-κB介导的凋亡途径 |
| 1.5.5 MAPK介导的凋亡途径 |
| 1.5.6 .其他凋亡途径 |
| 1.6 万通筋骨片研究进展 |
| 1.7 技术路线 |
| 第2章 万通筋骨片在类风湿性关节炎中的抗炎作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂与耗材 |
| 2.2.3 实验细胞与实验动物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 大鼠急毒实验 |
| 2.3.2 CIA大鼠模型建立 |
| 2.3.3 动物分组与给药 |
| 2.3.4 酶联免疫吸附试验 |
| 2.3.5 HE染色 |
| 2.3.6 免疫组化分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 万通筋骨片安全给药浓度 |
| 2.4.2 CIA大鼠模型 |
| 2.4.3 万通筋骨片对RA具有抗炎作用 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 万通筋骨片在类风湿性关节炎中的抗炎机制 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验试剂与耗材 |
| 3.2.3 实验细胞与实验动物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 万通筋骨片溶液配制 |
| 3.3.2 RA-FLSs细胞培养 |
| 3.3.3 细胞形态观察 |
| 3.3.4 RA-FLSs细胞增殖检测 |
| 3.3.5 蛋白免疫印迹分析 |
| 3.3.6 实时荧光定量PCR分析 |
| 3.3.7 细胞免疫荧光 |
| 3.3.8 质粒转染 |
| 3.3.9 Caspase-3/9蛋白酶活性检测 |
| 3.3.10 免疫组化分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 万通筋骨片乙醇提取物对RA-FLSs细胞的影响 |
| 3.4.2 MEK/ERK信号通路介导万通筋骨片的抗炎作用 |
| 3.4.3 万通筋骨片乙醇提取物促进RA-FLSs细胞凋亡 |
| 3.4.4 线粒体依赖性凋亡途径介导万通筋骨片的抗炎作用 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 基于RNA高通量测序挖掘万通筋骨片对RA的抗炎靶点 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验试剂与耗材 |
| 4.2.3 实验分析软件 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 RA-FLSs细胞培养与分组 |
| 4.3.2 样品收集和准备 |
| 4.3.3 数据分析 |
| 4.3.4 实时荧光定量PCR |
| 4.3.5 蛋白免疫印迹 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 DESeq2差异分析 |
| 4.4.2 差异基因功能注释分析 |
| 4.4.3 KEGG富集通路提取及蛋白互作网络分析 |
| 4.4.4 STEM时间聚类分析 |
| 4.4.5 权重共表达网络分析及功能富集分析 |
| 4.4.6 基因共表达网络分析及蛋白互作网络分析 |
| 4.4.7 核心基因筛选与验证 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 基于16S高通量测序和代谢组学联合分析挖掘万通筋骨片对RA的抗炎靶点 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验仪器 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 实验分析软件 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 16S rDNA扩增子测序 |
| 5.3.2 16S rDNA扩增子信息分析 |
| 5.3.3 代谢物提取 |
| 5.3.4 色谱条件 |
| 5.3.5 质谱条件 |
| 5.3.6 代谢物鉴定 |
| 5.3.7 肠道菌群与代谢物联合分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 万通筋骨片改变CIA大鼠肠道菌群结构 |
| 5.4.2 万通筋骨片作用特定肠道菌群 |
| 5.4.3 万通筋骨片改变CIA大鼠血清代谢物谱 |
| 5.4.4 差异代谢物筛选 |
| 5.4.5 靶点代谢物筛选 |
| 5.4.6 16S rDNA高通量测序与代谢物组学联合分析 |
| 5.5 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 附表 |
（4）乳杆菌和双歧杆菌对类风湿性关节炎的缓解作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 类风湿性关节炎的概述 |
| 1.1.1 类风湿性关节炎的病因及机制 |
| 1.1.2 类风湿性关节炎的动物模型 |
| 1.1.3 类风湿性关节炎的临床治疗 |
| 1.2 类风湿性关节炎与肠道菌群的关联 |
| 1.2.1 肠道微生态与免疫应答 |
| 1.2.2 类风湿性关节炎患者肠道微生物特征 |
| 1.2.3 乳杆菌对类风湿性关节炎的影响 |
| 1.2.4 双歧杆菌对类风湿性关节炎的影响 |
| 1.3 乳酸菌缓解类风湿性关节炎潜在机制 |
| 1.3.1 乳酸菌调节肠道微生物 |
| 1.3.2 乳酸菌调节免疫应答 |
| 1.3.3 乳酸菌调节肠道代谢物 |
| 1.4 立题背景及意义 |
| 1.5 主要研究内容 |
| 第二章 甲氨喋呤治疗的类风湿性关节炎患者肠道菌群分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与设备 |
| 2.2.1 实验材料与试剂 |
| 2.2.2 实验仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 粪便基因组抽提 |
| 2.3.2 16S rDNA V3-V4区、双歧杆菌和乳杆菌groEL基因扩增 |
| 2.3.3 目的条带的检测和纯化 |
| 2.3.4 16S rDNA文库构建 |
| 2.3.5 生物信息学分析 |
| 2.3.6 粪便短链脂肪酸分析 |
| 2.3.7 数据统计及分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 甲氨喋呤治疗的类风湿性关节炎患者肠道菌群分析 |
| 2.4.2 甲氨喋呤治疗的类风湿性关节炎患者肠道乳杆菌分析 |
| 2.4.3 甲氨喋呤治疗的类风湿性关节炎患者肠道双歧杆菌分析 |
| 2.4.4 甲氨喋呤治疗的类风湿性关节炎患者粪便短链脂肪酸分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 具有缓解类风湿性关节炎作用的乳杆菌的筛选 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与设备 |
| 3.2.1 实验材料与试剂 |
| 3.2.2 实验仪器及设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 乳杆菌培养及乳杆菌组合液的制备 |
| 3.3.2 动物实验方案 |
| 3.3.3 关节炎疾病程度分析 |
| 3.3.4 膝关节病理分析 |
| 3.3.5 大鼠血清自身抗体及细胞因子的测定 |
| 3.3.6 大鼠肠道菌群分析 |
| 3.3.7 大鼠粪便短链脂肪酸分析 |
| 3.3.8 数据统计与分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 乳杆菌对CIA大鼠临床表征的影响 |
| 3.4.2 乳杆菌对CIA大鼠关节病理的影响 |
| 3.4.3 乳杆菌对CIA大鼠自身抗体的影响 |
| 3.4.4 乳杆菌对CIA大鼠促炎因子的影响 |
| 3.4.5 乳杆菌对CIA大鼠Th1/Th17细胞免疫因子的影响 |
| 3.4.6 乳杆菌对CIA大鼠肠道菌群的影响 |
| 3.4.7 乳杆菌对CIA大鼠肠道短链脂肪酸的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 具有缓解类风湿性关节炎作用的双歧杆菌的筛选 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与设备 |
| 4.2.1 实验材料与试剂 |
| 4.2.2 实验仪器及设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 双歧杆菌培养及双歧杆菌组合液的制备 |
| 4.3.2 动物实验方案 |
| 4.3.3 关节炎疾病程度分析 |
| 4.3.4 大鼠肠系膜淋巴结Treg细胞分析 |
| 4.3.5 膝关节病理分析 |
| 4.3.6 大鼠血清免疫自身抗体及炎症因子的检测 |
| 4.3.7 大鼠回肠组织ZO-1和Occludin转录水平分析 |
| 4.3.8 大鼠肠道菌群分析 |
| 4.3.9 大鼠粪便短链脂肪酸分析 |
| 4.3.10 数据统计与分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 双歧杆菌对CIA大鼠临床表征的影响 |
| 4.4.2 双歧杆菌对CIA大鼠关节病理的影响 |
| 4.4.3 双歧杆菌对CIA大鼠自身抗体的影响 |
| 4.4.4 双歧杆菌对CIA大鼠促炎因子的影响 |
| 4.4.5 双歧杆菌对CIA大鼠Treg/Th17细胞的影响 |
| 4.4.6 双歧杆菌对CIA大鼠紧密连接的影响 |
| 4.4.7 双歧杆菌对CIA大鼠肠道菌群的影响 |
| 4.4.8 双歧杆菌对CIA大鼠肠道短链脂肪酸的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 干酪乳杆菌和短双歧杆菌单菌对类风湿性关节炎的缓解作用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与设备 |
| 5.2.1 实验材料与试剂 |
| 5.2.2 实验仪器及设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 干酪乳杆菌和短双歧杆菌培养及菌液制备 |
| 5.3.2 动物实验方案 |
| 5.3.3 关节炎疾病程度分析 |
| 5.3.4 大鼠肠系膜淋巴结Treg细胞分析 |
| 5.3.5 膝关节病理分析 |
| 5.3.6 踝关节Micro-CT分析 |
| 5.3.7 大鼠血清自身抗体及炎症因子的检测 |
| 5.3.8 大鼠回肠组织ZO-1和Occludin转录水平分析 |
| 5.3.9 大鼠肠道菌群分析 |
| 5.3.10 大鼠肠道短链脂肪酸分析 |
| 5.3.11 数据统计与分析 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 干酪乳杆菌和短双歧杆菌单菌对CIA大鼠临床表征及关节滑膜炎症的影响 |
| 5.4.2 干酪乳杆菌和短双歧杆菌单菌对CIA大鼠系统性和局部免疫的影响 |
| 5.4.3 干酪乳杆菌和短双歧杆菌单菌对CIA大鼠紧密连接的影响 |
| 5.4.4 干酪乳杆菌和短双歧杆菌单菌对CIA大鼠肠道菌群的影响 |
| 5.4.5 干酪乳杆菌和短双歧杆菌单菌对CIA大鼠短链脂肪酸的影响 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 干酪乳杆菌CCFM1074和短双歧杆菌CCFM1078缓解类风湿性关节炎的机制探究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与设备 |
| 6.2.1 实验材料与试剂 |
| 6.2.2 实验仪器及设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 动物实验方案 |
| 6.3.2 DNA样品制备、宏基因组测序及数据处理 |
| 6.3.3 RNA样品制备、转录组测序及数据处理 |
| 6.3.4 粪便样品制备、非靶向代谢组分析及数据处理 |
| 6.3.5 数据统计与分析 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 基于宏基因组探究干酪乳杆菌 CCFM1074和短双歧杆菌CCFM1078对CIA大鼠肠道菌群结构及功能的影响 |
| 6.4.2 基于非靶向代谢组探究干酪乳杆菌 CCFM1074和短双歧杆菌CCFM1078对CIA大鼠粪便代谢物的影响 |
| 6.4.3 基于转录组探究干酪乳杆菌 CCFM1074和短双歧杆菌CCFM1078对CIA大鼠结肠基因表达及功能的影响 |
| 6.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
| 附录 Ⅱ |
（5）膝骨关节炎患者肠道菌群与代谢变化及桂皮醛对兔膝骨关节炎模型肠道菌群及巨噬细胞极化影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 上篇 文献综述 |
| 综述一 肠道菌群失调与骨关节炎疾病的研究进展 |
| 微生物概述 |
| (一) 骨关节炎发病机制 |
| (二) “肠-骨”轴 |
| (三) 肠道菌群与关节炎的相关性 |
| (四) 以肠道菌群为靶点治疗OA |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述二 桂皮醛的生物功能及其临床应用研究 |
| 1. 抗炎作用 |
| 2.抗菌活性 |
| 3. 抗肿瘤作用 |
| 4. 心脏保护功能 |
| 5. 产热效应 |
| 6. 抗糖尿病 |
| 7. 抗肥胖作用 |
| 8. 抗血栓作用 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 下篇 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 基于肠道菌群与LC-MS非靶向代谢组学研究人膝关节骨性关节炎的生物学特征 |
| 0 研究对象 |
| 1 要实验仪器和试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 基于肠道菌群与巨噬细胞极化探讨桂皮醛干预兔膝骨关节炎的免疫机制 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 附录1 Lequesne MG 评分 |
| 附录2 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（6）昆断益母方调控Treg/Th17细胞失衡和抗类风湿关节炎的机制研究（论文提纲范文）
| 答辩委员会名单及评定意见 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 类风湿关节炎研究概况 |
| 1.2 中医药治疗类风湿关节炎研究概况 |
| 1.3 TH17/TREG细胞平衡与类风湿关节炎的研究进展 |
| 1.4 研究目的 |
| 第二章 实验研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验细胞 |
| 2.1.3 主要实验试剂和耗材 |
| 2.1.4 主要实验仪器和设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 药物的准备和保存 |
| 2.2.2 CIA模型制备 |
| 2.2.3 动物实验分组及处理方法 |
| 2.2.4 小鼠踝关节HE染色 |
| 2.2.5 血清和PBMC细胞分离 |
| 2.2.6 组织RNA提取 |
| 2.2.7 细胞总RNA提取与定量 |
| 2.2.8 cDNA第一链合成 |
| 2.2.9 荧光定量PCR |
| 2.2.10 ELISA法检测细胞因子 |
| 2.2.11 细胞培养与传代 |
| 2.2.12 细胞的冻存与复苏 |
| 2.2.13 CD~(4+)T细胞磁珠分选及培养 |
| 2.2.14 细胞实验分组与药物干预 |
| 2.2.15 流式细胞术 |
| 2.2.16 细胞实验分组与药物干预 |
| 2.2.17 CCK8法检测细胞增殖 |
| 2.2.18 Transwell检测细胞迁移能力 |
| 2.2.19 Transwell检测细胞侵袭能力 |
| 2.2.20 数据统计处理 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 CIA小鼠关节指数评分 |
| 3.2 CIA小鼠踝关节组织HE染色 |
| 3.3 昆断益母方对CIA小鼠在免疫的第35天时PBMC中Foxp3和RORγt mRNA表达水平的影响 |
| 3.4 昆断益母方对CIA小鼠在免疫的第35天时关节滑膜组织中Foxp3和RORγt mRNA表达水平的影响 |
| 3.5 昆断益母方对CIA小鼠在免疫的第35天时PBMC中IL-1β、IL-17、TNF-α、IL-10表达水平的影响 |
| 3.6 昆断益母方对CIA小鼠在免疫的第35天时血清中MIR-21-5P表达水平的影响 |
| 3.7 昆断益母方对CIA小鼠在免疫的第35天时关节滑膜组织中MIR-21-5P表达水平的影响 |
| 3.8 昆断益母方对CIA小鼠在免疫的第35天时血清中TLR4和STAT3 mRNA表达水平的影响 |
| 3.9 昆断益母方对CIA小鼠在免疫的第35天时关节滑膜组织中TLR4和STAT3 mRNA表达水平的影响 |
| 3.10 昆断益母方对CIA小鼠在免疫的第35天时关节软骨组织中TLR4和STAT3 mRNA表达水平的影响 |
| 3.11 昆断益母方对初始T细胞中炎症因子IL-17、IL-1β、TNF-α和IL-10 mRNA表达水平的影响 |
| 3.12 昆断益母方对初始T细胞分化的TH17细胞和TREG细胞比例的影响 |
| 3.13 昆断益母方对初始T细胞与滑膜细胞共培养后细胞的增殖的影响 |
| 3.14 昆断益母方对初始T细胞与滑膜细胞共培养后细胞迁移和侵袭的影响 |
| 3.15 昆断益母方对初始T细胞与滑膜细胞共培养后细胞中MIR-21-5P表达的影响 |
| 3.16 昆断益母方对初始T细胞与滑膜细胞共培养后细胞中Foxp3和RORγt mRNA表达的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 昆断益母方能改善CIA小鼠类风湿性关节炎症状 |
| 4.2 昆断益母方能改善CIA小鼠体内TREG/TH17细胞比例 |
| 4.3 昆断益母方能改善CIA小鼠体内炎症因子表达水平 |
| 4.4 昆断益母方能上调CIA小鼠体内MIR-21-5P表达水平 |
| 4.5 昆断益母方能降低CIA小鼠体内TLR4和STAT3表达水平 |
| 4.6 昆断益母方能抑制FLS细胞的迁移和侵袭 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（7）从肝论治针灸对OA模型大鼠软骨损伤的效应机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 实验一 改良Hulth法建立OA模型及检测模型中昼夜节律蛋白Bmal1、Clock的表达 |
| 1 材料、仪器、试剂 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物分组及处理 |
| 2.2 动物模型制备 |
| 2.3 行为学观察指标及方法 |
| 2.4 取材及检测方法 |
| 2.5 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 旷场实验 |
| 3.2 足底痛阈测试实验 |
| 3.3 大鼠关节活动度 |
| 3.4 大鼠膝关节影像学检查 |
| 3.5 软骨标本HE染色及Mankin′s评分 |
| 3.6 免疫酶联ELISA法检测关节液中IL-1β、TNF-α的含量 |
| 3.7 免疫荧光法检测软骨组织中Bmal1、Clock蛋白的表达 |
| 3.8 免疫印迹法检测软骨组织中Bmal1、Clock蛋白的含量 |
| 4 讨论 |
| 4.1 目前使用的膝骨关节炎动物模型 |
| 4.2 模型成功的依据 |
| 4.3 关节炎模型昼夜节律存在异常 |
| 实验二 不同配穴方法对大鼠OA模型炎症及昼夜节律蛋白Bmal1、Clock的影响 |
| 1 材料、仪器、试剂 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物分组及处理 |
| 2.2 动物模型制备 |
| 2.3 针刺治疗方法 |
| 2.4 行为学观察指标及方法 |
| 2.5 取材及检测方法 |
| 2.6 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 旷场实验 |
| 3.2 足底痛阈测试实验 |
| 3.3 大鼠关节活动度 |
| 3.4 软骨标本HE染色及Mankin′s评分 |
| 3.5 免疫酶联ELISA法检测关节液中IL-1β、TNF-α |
| 3.6 免疫荧光法检测软骨组织中Bmal1、Clock蛋白的表达 |
| 3.7 免疫印迹法检测软骨组织中Bmal1、Clock蛋白的含量 |
| 4 讨论 |
| 4.1 针灸疗法的取穴规律 |
| 4.2 从肝论治针灸治疗OA的理论依据 |
| 4.3 从肝论治针灸治疗OA的探讨 |
| 实验三 从肝论治针灸调控昼夜节律蛋白Bmal1、Clock介导ERK1/2信号通路抑制大鼠OA模型炎症的机制 |
| 1 材料、仪器、试剂 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物分组及处理 |
| 2.2 动物模型制备及ERK抑制剂使用方法 |
| 2.3 针刺治疗方法 |
| 2.4 取材及检测方法 |
| 2.5 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 软骨标本HE染色及Mankin’s评分 |
| 3.2 免疫酶联ELISA法检测关节液中IL-1β、TNF-α |
| 3.3 免疫荧光法检测软骨组织中Bmal1、Clock、P-ERK、IL-1β、TNF-α蛋白的表达 |
| 3.4 免疫印迹法检测软骨组织中p-ERK、IL-1β、TNF-α、Bmal1、Clock蛋白的含量 |
| 4 讨论 |
| 4.1 MAPK/ERK信号通路的介绍 |
| 4.2 软骨基质与ERK1/2 信号通路的关系 |
| 4.3 炎症因子与ERK1/2 信号通路的关系 |
| 4.4 从肝论治针灸对大鼠ERK1/2 信号通路的影响 |
| 全文讨论 |
| 1 中医对OA的认识 |
| 1.1 病名 |
| 1.2 病因病机 |
| 1.3 辨证分型 |
| 1.4 针灸治疗OA的概况 |
| 2 现代医学对膝骨关节炎的研究进展 |
| 2.1 现代医学对OA发病机制的认识 |
| 2.2 炎症物质对OA的影响 |
| 2.3 昼夜节律失常对OA的影响 |
| 2.4 ERK1/2 信号通路对OA的影响 |
| 3 “补疏结合”是从肝论治针灸防治OA的重要取穴原则 |
| 结语 |
| 本研究的创新点 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 文献综述 从肝论治针灸治疗膝骨关节炎的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录二 博士期间发表论文及参与课题 |
| 致谢 |
（8）壮药龙钻通痹方调控BMP2/Smads信号通路对成骨细胞增殖的影响及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1.类风湿关节炎的发病原因及发病率 |
| 2.西医对类风湿关节炎的认识及研究进展 |
| 2.1 西医对于类风湿关节炎的认识 |
| 2.2 类风湿关节炎西医治疗的研究进展 |
| 3.中医对于类风湿关节炎的认识及研究进展 |
| 3.1 中医对类风湿关节炎病因病机的认识 |
| 3.2 类风湿关节炎的中医治疗研究概况 |
| 3.2.1 中医内服治疗RA |
| 3.2.2 中医外治治疗RA |
| 4.壮医对类风湿关节炎的认识及研究进展 |
| 4.1 壮医对类风湿关节炎病因病机的认识 |
| 4.2 壮医治疗类风湿关节炎 |
| 4.2.1 壮药内服治疗RA |
| 4.2.2 壮医外治治疗RA |
| 5.小结 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 动物来源 |
| 1.3 实验药物及试剂 |
| 1.3.1 实验药物 |
| 1.3.2 实验试剂 |
| 1.4 实验主要仪器设备 |
| 2.实验方法与结果 |
| 2.1 实验方法 |
| 2.1.1 细胞培养、传代与冻存 |
| 2.1.2 含药血清的制备 |
| 2.1.3 MTT实验 |
| 2.1.4 实时定量聚合酶链反应(QRT-PCR)实验 |
| 2.1.5 蛋白质印迹(WESTERN BLOT,WB)实验 |
| 2.1.6 统计方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 甲氨蝶呤组及壮药龙钻通痹方低、中、高剂量组含药血清对MC3T3-E1 SUBCLONE14 细胞增殖活性的影响 |
| 2.2.2 甲氨蝶呤组及壮药龙钻通痹方低、中、高剂量组含药血清对MC3T3-E1 subclone 14细胞中BMP2、SMADs、RUNX2基因表达的影响 |
| 2.2.3 甲氨蝶呤及壮药龙钻通痹方低、中、高剂量组含药血清对BMP2、SMADS、RUNX2 蛋白表达的影响 |
| 2.2.4 甲氨蝶呤及壮药龙钻通痹方对大鼠体重及心肝脾肺肾指数的影响 |
| 第三部分 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 综述 中医药基于BMP2-Smads信号通路调控成骨细胞增殖与分化的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及攻读学位期间科研经历 |
（9）非变性Ⅱ型胶原蛋白改善骨关节炎的研究进展（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 非变性Ⅱ型胶原蛋白的简介及作用机理 |
| 1.1 非变性Ⅱ型胶原蛋白的简介 |
| 1.2 影响骨关节炎的分子因素 |
| 1.3 非变性Ⅱ型胶原蛋白改善骨关节炎的作用机理 |
| 2 国内外关于非变性Ⅱ型胶原蛋白改善骨关节炎的研究 |
| 2.1 非变性胶原蛋白对动物性骨关节改善的研究状况 |
| 2.2 非变性胶原蛋白对人体骨关节炎改善的研究状况 |
| 3 目前用于治疗骨关节炎的非手术方式 |
| 4 结论与展望 |
（10）针刺内外膝眼治疗KOA临床疗效观察及对KOA模型大鼠NF-κB信号通路水平的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 国内外治疗膝骨关节炎研究进展 |
| 1.病因病机 |
| 2.临床常用之治疗方法 |
| 3.针灸改善KOA的作用机制 |
| 4.小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 膝骨关节炎动物模型建立之研究现状 |
| 1.鼠类模型之制作 |
| 2.兔模型之制作 |
| 3.其他动物模型之制作 |
| 4.相关检测手段和评价之方式 |
| 5.问题与展望 |
| 参考文献 |
| 综述三 基于《灵枢》解结理论探讨针刀和圆利针对膝骨关节炎的治疗 |
| 1.解结之“结”含意 |
| 2.痹证与KOA之关系 |
| 3.膝痹KOA与解结之关系 |
| 4.小结及展望 |
| 研究假说及设想 |
| 参考文献 |
| 第二部分 临床研究 研究: 基于解结理论,探讨针刀、圆利针治疗KOA的作用机制 |
| 前言 |
| 1.资料与方法 |
| 2.实验研究结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 动物试验 |
| 试验一 针刀、圆利针干预对KOA模型大鼠的膝关节组织形态及生物力学之影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2.试验结果 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 试验二 针刀、圆利针干预对KOA模型大鼠信号通路之调控影响 |
| 前言 |
| 1.试验材料与方法 |
| 2.试验结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 参考文献 |
| 研究结论 |
| 创新与不足 |
| 附录 |
| 附录1.临床研究的相关评价标准 |
| 附录2.试验动物研究的相关操作及流程 |
| 致谢 |
四、口服Ⅱ型胶原诱导免疫耐受对大鼠类风湿性关节炎和创伤性骨性关节炎的影响（论文参考文献）
- [1]LncRNA PlncRNA-1靶向miR-146a/TGF-β1轴参与类风湿性关节炎发生发展机制研究[D]. 汪洋. 新疆医科大学, 2021
- [2]SNX10在小鼠创伤性骨关节炎运动干预中的作用研究[D]. 王淼. 上海体育学院, 2021(09)
- [3]万通筋骨片对类风湿关节炎的抗炎机制研究及16S rDNA高通量测序和代谢组学分析[D]. 李兆东. 吉林大学, 2021(01)
- [4]乳杆菌和双歧杆菌对类风湿性关节炎的缓解作用及机制研究[D]. 樊哲新. 江南大学, 2021(01)
- [5]膝骨关节炎患者肠道菌群与代谢变化及桂皮醛对兔膝骨关节炎模型肠道菌群及巨噬细胞极化影响的研究[D]. 谢坤铭. 北京中医药大学, 2021(01)
- [6]昆断益母方调控Treg/Th17细胞失衡和抗类风湿关节炎的机制研究[D]. 范氏绒. 广州中医药大学, 2021
- [7]从肝论治针灸对OA模型大鼠软骨损伤的效应机制研究[D]. 周晓红. 湖北中医药大学, 2021(01)
- [8]壮药龙钻通痹方调控BMP2/Smads信号通路对成骨细胞增殖的影响及其作用机制研究[D]. 张译敏. 广西中医药大学, 2021(02)
- [9]非变性Ⅱ型胶原蛋白改善骨关节炎的研究进展[J]. 王文娟. 食品安全质量检测学报, 2021(05)
- [10]针刺内外膝眼治疗KOA临床疗效观察及对KOA模型大鼠NF-κB信号通路水平的影响[D]. 李惠娟. 北京中医药大学, 2020(04)