一、17-β雌二醇对大鼠脑缺血再灌注后Bcl-2表达的影响（论文文献综述）
贾冬雪[1]（2021）在《荭草苷对脑缺血再灌注大鼠脑组织线粒体自噬的作用及机制研究》文中认为线粒体是缺血后神经细胞死亡的关键靶区,也是决定神经细胞能否存活的关键因素。对于能量需求高的神经细胞,及时有效地清除损伤的线粒体对维持细胞的正常生理活动至关重要。线粒体自噬是机体内有效清除受损线粒体的重要机制之一,对维持线粒体质量和数量的稳态平衡具有重要意义。若线粒体自噬过度激活也会导致细胞发生自噬性死亡,进一步加重脑组织损伤。荭草苷和牡荆苷是中药金莲花和荭草中的主要活性成分,两者结构仅在B环上相差一个酚羟基。前期研究发现荭草苷和牡荆苷对脑缺血再灌大鼠具有脑保护作用,其可能是通过抗炎、抗氧化应激、降低兴奋性氨基酸谷氨酸对神经细胞毒性来达到目的。但化学结构差异对荭草苷和牡荆苷脑保护作用的影响以及线粒体自噬在荭草苷或牡荆苷保护神经细胞中的作用仍不清楚。本实验以局灶性脑缺血再灌注大鼠为实验对象,探讨化学结构差异对荭草苷和牡荆苷的神经保护作用的影响以及线粒体自噬在荭草苷减轻大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用及其作用机制。第一部分荭草苷和牡荆苷对脑缺血再灌注大鼠神经保护作用效果的比较目的考察化学结构差异对荭草苷和牡荆苷神经保护作用的影响。方法选用健康SPF雄性SD大鼠,体质量250-280g,使用线栓法制备大鼠脑右侧中动脉阻塞（MCAO）模型,将制备成功的大鼠随机分为脑缺血再灌注（I/R）组、荭草苷组、牡荆苷组,假手术组作对照组。荭草苷组和牡荆苷组于术后1 h和12 h腹腔注射6.48μmol·kg-1荭草苷溶液和牡荆苷溶液两次,假手术组和I/R组给予相同剂量的溶剂+0.9%Na Cl溶液;再灌注24 h后,Zea-Longa评分法对各组大鼠进行神经功能缺陷评分,TTC法测定大鼠脑梗死体积和脑半球肿胀,HE染色观察各组大鼠神经细胞形态。结果与假手术组相比,I/R组大鼠脑梗死体积、神经功能缺陷评分和半球肿胀百分比均显着增加（P<0.01）;与I/R组相比,荭草苷和牡荆苷处理组大鼠脑梗死体积、神经功能缺损评分和半球肿胀均明显降低（P<0.01）,其中荭草苷组降低程度稍高于牡荆苷组;HE结果显示,I/R组大鼠神经细胞形态明显变形,细胞皱缩和水肿程度严重;给予荭草苷和牡荆苷治疗后神经细胞皱缩和水肿情况改善,细胞形态明显好转。结论荭草苷对脑缺血再灌注大鼠的脑保护作用优于牡荆苷,选择荭草苷用于下一步研究。第二部分荭草苷对脑缺血再灌注大鼠脑组织线粒体功能和线粒体自噬的影响目的考察荭草苷对脑缺血再灌注大鼠脑组织线粒体功能和线粒体自噬的影响。方法选用健康SPF雄性SD大鼠,体质量250-280 g,使用线栓法制备大鼠脑右侧中动脉阻塞（MCAO）模型,将模型制备成功的大鼠随机分为I/R组、荭草苷组、荭草苷+雷帕霉素组,假手术组作对照组。荭草苷给药组于术后1 h和12 h腹腔注射6.48μmol·kg-1荭草苷溶液溶液两次,荭草苷+雷帕霉素组于术前24 h和30 min腹腔注射2.66 mg·m L-1雷帕霉素溶液两次,假手术组和I/R组给予相同剂量的溶剂+0.9%Na Cl溶液;再灌注24 h后,Zea-Longa评分法对各组大鼠进行神经功能损伤评分,TTC法测定大鼠脑梗死体积和半球肿胀,测定大鼠缺血侧脑组织线粒体中ATP酶(Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶)和SDH酶活性以及Ca2+和MDA含量,western blot法测定大鼠缺血侧脑组织线粒体中自噬相关蛋白LC3和BNIP3表达水平。结果与模型组相比,荭草苷给药组大鼠脑梗死体积、神经功能损伤评分和半球肿胀程度明显降低（P<0.05,P<0.01）,线粒体中ATP酶和SDH酶活性显着增强（P<0.05,P<0.01）,而Ca2+含量和MDA含量明显降低（P<0.05,P<0.01）;与荭草苷组相比,荭草苷联合雷帕霉素处理后大鼠脑梗死体积和半球肿胀明显增加（P<0.05）,线粒体中ATP酶和SDH酶活性明显降低（P<0.05）,而Ca2+含量和MDA含量则明显升高（P<0.05）。Western-blot结果显示,I/R组大鼠缺血侧脑组织纯化线粒体中LC3和BNIP3表达增多（P<0.01）,线粒体自噬被激活;与I/R组相比,荭草苷给药组大鼠脑线粒体中LC3和BNIP3蛋白表达量显着降低（P<0.05,P<0.01）;与荭草苷组相比,雷帕霉素可以逆转荭草苷对MCAO大鼠脑组织线粒体自噬的抑制作用,增加大鼠脑线粒体中LC3和BNIP3蛋白的表达（P<0.05）。结论荭草苷通过抑制线粒体自噬过度激活可有效减轻脑缺血再灌注导致的能量代谢障碍、线粒体氧化应激和钙超载,改善线粒体功能。第三部分荭草苷对脑缺血再灌注大鼠脑组织PI3K/Akt通路影响目的考察荭草苷对脑缺血再灌注大鼠脑组织PI3K/Akt通路的影响。方法选用健康SPF雄性SD大鼠,体质量250-280g,使用线栓法制备大鼠脑右侧中动脉阻塞（MCAO）模型,将制备成功的大鼠随机分为I/R组、荭草苷组、荭草苷+LY294002组和LY294002组,假手术组作对照组。荭草苷给药组于术后1 h和12 h腹腔注射6.48μmol·kg-1荭草苷溶液两次,荭草苷+LY294002组和LY294002组于术前24 h和30min腹腔注射2.60 mg·m L-1的LY294002溶液两次,假手术组和模型组给予相同剂量的溶剂+0.9%Na Cl溶液;再灌注24 h后,Zea-Longa评分法对各组大鼠进行神经功能缺损评分,TTC法测定大鼠脑梗死体积和半球肿胀,western blot法测定大鼠缺血侧脑组织线粒体中自噬相关蛋白LC3和BNIP3和胞浆中p-Akt和Akt蛋白表达水平。结果与荭草苷组相比,给予抑制剂LY294002干预后,荭草苷对MCAO大鼠的脑保护作用减弱,表现为大鼠脑梗死体积和神经功能缺损评分以及半球肿胀显着增加（P<0.05）。Western blot结果显示,与I/R组相比,荭草苷组大鼠脑组织线粒体中LC3和BNIP3蛋白水平明显降低（P<0.05,P<0.01）,胞浆中p-Akt的相对表达量显着增加（P<0.01）;与荭草苷组相比,荭草苷+LY294002处理组大鼠LC3和BNIP3蛋白表达明显增加（P<0.05）,p-Akt相对表达量显着降低（P<0.05）。结论荭草苷对脑缺血再灌注大鼠脑保护作用可能是通过激活PI3K/Akt信号通路抑制脑缺血再灌注大鼠线粒体自噬过度激活来实现的。
刘玥欣[2]（2021）在《基于PI3K/AKT信号通路探讨鹿茸多肽改善轻度认知功能障碍的作用机制研究》文中提出目的:本研究基于PI3K/AKT信号通路探讨鹿茸多肽（Velvet antler peptide,VAP）对神经元修复及保护作用,阐释VAP改善轻度认知功能障碍（Mild Cognitive Impairment,MCI）作用机制,为临床鹿茸防治MCI提供依据。方法:本研究利用体内、体外实验,探讨VAP通过调控PI3K/AKT信号通路改善MCI作用机制。1 VAP鉴定及检测利用双缩脲法鉴定VAP理化性质;利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验（SDSPolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）测定VAP分子量;利用柱前衍生化-高效液相色谱法（Precolumn derivatization-High performance liquid chromatography,PD-HPLC）测定VAP不同成分含量。2基于网络药理学探讨鹿茸改善MCI的作用机制利用TCMID数据库、Pubchem数据库筛选鹿茸活性成分及靶点;利用OMIM数据库、Disgenet数据库、Genecards数据库筛选MCI作用靶点;利用Venny 2.1在线作图工具平台筛选鹿茸-MCI作用靶点;利用STRING 11.0蛋白质互作平台构建蛋白-蛋白相互作用（Protein-protein interaction,PPI）网络,利用Cytoscape 3.8.0网络拓扑属性分析软件,基于拓扑分析、聚类分析筛选PPI网络核心靶点;利用Cytoscape 3.8.0网络拓扑属性分析软件构建“中药-成分-靶点-疾病”网络模型,分析核心成分;利用R语言及Bioconductor生物信息软件,进行基因本体论（Gene ontology,GO）富集分析以及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）富集分析,对共同靶点所涉及的生物学过程、主要代谢通路等进行归纳。3基于PI3K/AKT信号通路探讨VAP改善不同MCI模型大鼠认知功能障碍的作用机制采用腹腔注射东莨菪碱法、单侧颈总动脉结扎法分别诱导不同MCI大鼠模型。利用旷场实验、Morris水迷宫实验观察VAP对不同MCI模型大鼠行为学变化的影响;利用苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin staining,HE）观察VAP对不同MCI模型大鼠海马区病理学变化的影响;利用ELISA检测VAP对不同MCI模型大鼠血清中SOD、MDA、脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor,BDNF）、神经生长因子（Nerve growth factor,NGF）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）、睾酮（Testosterone,T）、皮质醇（Cortisol）含量变化的影响;利用Western Blot检测VAP对不同MCI模型大鼠海马区PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达水平的影响。4基于代谢组学分析VAP改善MCI模型大鼠认知功能障碍的作用机制利用超高效液相色谱-串联四级杆飞行时间二级质谱联用（UPLC-Q/TOF-MS）代谢组学技术对由腹腔注射东莨菪碱法复制的MCI模型大鼠脑组织、肾脏进行检测,分析各组间差异代谢物、代谢通路动态变化情况。5基于PI3K/AKT信号通路探讨VAP拮抗由冈田酸（Okadaic acid,OA）诱导的受损HT22细胞的作用机制利用OA诱导HT22细胞损伤建立模型,给药后,利用CCK-8法检测HT22细胞活性,WST-1法、可分光光度法检测HT22细胞中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-PX）活力或含量变化的影响,Western Blot检测HT22细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达水平。结果:1 VAP鉴定及检测实验中选用的VAP理化性质为蛋白质,分子量约为3.2k Da,由17种氨基酸组成,其中必须氨基酸共有7种,含量为393.39±1.65g/kg,氨基酸总含量为826.55±10.75g/kg,不同成分含量稳定,可用于本实验研究。2基于网络药理学探讨鹿茸改善MCI的作用机制鹿茸中多数活性成分为VAP中的重要构建物质,利用交互网络发现鹿茸活性成分可能通过PI3K/AKT信号通路发挥改善MCI作用,作用机制可能与调控体内神经信号转导、神经元损伤、氧化应激过程、性激素类作用等途径相关,为本研究探讨VAP对MCI的改善作用提供方法与思路。3基于PI3K/AKT信号通路探讨VAP改善不同MCI模型大鼠认知功能障碍的作用机制VAP能够提高不同MCI模型大鼠学习、记忆能力,改善海马区固缩现象,增加不同MCI模型大鼠血清中SOD、BDNF、NGF、VEGF、T、Cortisol含量（P<0.05或P<0.01）,减少MDA含量（P<0.05或P<0.01）,升高Bcl-2、m TOR表达水平（P<0.05或P<0.01）,降低Bad、Bax、Caspase-3蛋白表达水平（P<0.05或P<0.01）,上调PI3K/AKT信号通路的表达（P<0.05或P<0.01）。4基于代谢组学分析VAP改善MCI模型大鼠认知功能障碍的作用机制VAP改善MCI模型大鼠认知功能障碍作用机制可能与调控脑内叶酸及脂质代谢、环磷酸腺苷能量循环、氨基酸生物合成,以及肾脏中性激素分泌等多种途径相关。5基于PI3K/AKT信号通路探讨VAP拮抗由冈田酸（Okadaic acid,OA）诱导的受损HT22细胞的作用机制VAP能够提高受损HT22细胞存活率（P<0.01）,增强受损HT22细胞中SOD、GSH-PX活力（P<0.01）,减少MDA含量（P<0.01）,降低Bad、Bax、Caspase-3蛋白表达水平（P<0.01）,上调PI3K/AKT信号通路的表达（P<0.01）。结论:VAP可能通过“填精补髓”作用调控PI3K/AKT信号通路,拮抗由OA诱导的受损HT22细胞,并提高不同MCI模型大鼠学习、记忆能力,调节肾脏功能、促进神经元细胞生长、增殖与分化,保护中枢神经系统,作用机制可能与调控脑内叶酸及脂质代谢、环磷酸腺苷能量循环、氨基酸生物合成,以及肾脏中性激素分泌等多种途径相关。
杨艳艳[3]（2021）在《雌激素对血管性痴呆大鼠认知功能及凋亡自噬相关蛋白和Wnt/β-catenin信号通路的影响》文中进行了进一步梳理血管性痴呆（Vascular dementia,VD）是由各种脑血管疾病（缺血或出血或急慢性缺氧性脑血管病等）导致脑功能障碍而引起的一组获得性认知功能障碍临床综合征。随着全球人口老龄化时代的到来,脑血管病患病人数逐年增多,VD已成为仅次于阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）导致认知功能障碍的第二大病因。迄今为止,VD的发病机制尚未完全明确,治疗方面主要是控制相关的心脑血管危险因素及伴随症状,缺乏确切有效的治疗药物。因此,深入探讨VD的发病机制,并寻求有效的VD防治药物显得尤为重要和迫切。雌激素是一种类固醇激素,不仅影响女性生殖系统,还能调节糖脂代谢、骨代谢,保护心血管系统。脑是雌激素作用的靶器官之一,雌激素受体广泛分布于海马、大脑皮层、下丘脑、基底前脑等与认知相关的区域。流行病学资料显示,脑卒中发病率在绝经前女性中明显低于同年龄阶段男性,但绝经后男女发病率无明显差异。近年研究发现,应用雌激素替代治疗的绝经后女性,其痴呆的发病率明显降低,表明雌激素可能是一种有希望的治疗VD的新方法。在中枢神经系统中,海马是学习记忆、信息处理和信号传输的重要部位,当海马受到缺血缺氧损伤时,细胞内多条信号转导通路出现异常,细胞凋亡及自噬同时激活,从而加速神经元的死亡。Wnt/β-catenin信号通路是一条在中枢神经系统发育过程中发挥重要作用的关键性通路,而且也参与各种细胞内程序,包括细胞增殖、存活、分化、调亡,是调控细胞生长、增殖分化的关键途径。但到目前为止,在血管性痴呆模型中,雌激素能否通过调节海马神经元凋亡、自噬及Wnt/β-catenin信号通路,从而影响VD大鼠学习记忆能力的文献报道很少。基于上述研究背景,本研究选取雌性SD大鼠,采用双侧卵巢切除术（Ovariectomy,OVX）联合双侧颈总动脉结扎术（Bilateral common carotid artery occlusion,BCCAO）制备去势VD大鼠模型,应用雌激素连续干预8周,采用Morris水迷宫评估大鼠学习和记忆能力的改善情况,采用HE染色和透射电子显微镜观察雌激素对海马神经元形态学影响,采用免疫组织化学染色和Western blot法观察雌激素对细胞凋亡、自噬相关蛋白的表达影响。在此基础上,进一步探讨雌激素发挥神经保护作用是否与激活Wnt/β-catenin信号转导通路有关,为雌激素改善认知障碍的作用机制提供更全面的理论依据。第一部分 去卵巢血管性痴呆大鼠模型的建立及雌激素对去卵巢血管性痴呆大鼠认知功能的影响目的:通过OVX联合BCCAO的方法,建立去势大鼠VD动物模型,通过行为学评估VD大鼠学习记忆能力,观察雌激素对VD大鼠认知功能的影响。方法:1.清洁级成年健康雌性SD大鼠48只,随机分为假手术组（sham组）、模型组（model组）、雌激素早期治疗组（E2-early组）、雌激素晚期治疗组（E2-later 组）。2.假手术组大鼠仅切除卵巢周围少量脂肪组织,其余三组大鼠予OVX术切除双侧卵巢。OVX术后1周,假手术组大鼠接受BCCAO假手术,其余三组大鼠接受BCCAO制备VD模型。3.E2-early组大鼠于BCCAO术后第一天开始接受17β-雌二醇（E2）腹腔注射,100 μg/kg/day,溶剂为芝麻油;E2-later组大鼠于BCCAO术后一周开始接受E2腹腔注射,100 ug/kg/day;假手术组和模型组大鼠分别接受等量芝麻油腹腔注射。每组大鼠每天腹腔注射一次,连续8周。4.最后一次给药的次日,对大鼠进行Morris水迷宫实验,评估大鼠的空间学习记忆能力。前5天为定位航行实验,第6天为空间探索实验。结果:1.定位航行实验将逃逸潜伏期（escape latency）即SD大鼠从入水到上台的时间,作为评估大鼠空间学习能力的指标。随着训练天数的增加,四组大鼠的平均逃逸潜伏期逐渐缩短,统计学显示同组各时间点逃逸潜伏期具有显着性差异（F=173.481,P<0.01）。在定位航行实验的第1天,四组大鼠的逃逸潜伏期尚无明显差异;在定位航行实验的第2～5天,模型组大鼠逃逸潜伏期较假手术组明显增加（第2天,P<0.05;第3～5天,P<0.01）。雌激素干预后,E2-early组大鼠逃逸潜伏期较模型组明显缩短（第3天和第4天,P<0.05;第5天,P<0.01）。E2-later组仅在第5天逃逸潜伏期较模型组明显缩短（P<0.05）。2.空间探索实验在实验的第6天,撤除平台,记录大鼠120秒内在原平台象限停留时间占总时间的百分比（目标象限时间百分比）、原平台象限路程占总路程的百分比（目标象限路程百分比）以及穿越原平台所在位置的次数（穿台次数）,作为评估大鼠空间记忆能力的指标。模型组大鼠目标象限时间百分比和路程百分比均明显缩短,表明BCCAO导致了大鼠记忆缺陷,而E2-early组大鼠目标象限时间百分比和路程百分比均较模型组明显增多。模型组大鼠穿台次数较假手术组显着减少;E2-early组大鼠穿台次数较模型组明显增加。虽然E2-later组大鼠的目标象限时间百分比、目标象限泳程百分比、穿台次数均高于模型组,但差异无统计学意义。3.四组大鼠游泳轨迹的变化大鼠初入水时随机游动寻找水下平台,游泳轨迹多在水迷宫边缘。随着训练天数增加,假手术组、雌激素治疗组大鼠寻台方式逐渐变为趋向式,尤其是假手术组大鼠的游泳轨迹甚至接近直线模式,而模型组大鼠直至训练结束,寻台方式仍多为边缘模式,反映出模型组大鼠出现了明显的认知功能损害。结论:1.通过OVX联合BCCAO方法能够成功建立去势VD大鼠模型,能模拟慢性脑低灌注造成的学习及记忆功能障碍。2.雌激素治疗可以明显改善VD大鼠的学习和记忆能力,并且早期雌激素干预比晚期雌激素干预更有效。第二部分 雌激素对血管痴呆性大鼠海马组织形态学的影响目的:观察VD大鼠海马神经元病理形态学的改变以及雌激素不同给药时机对VD大鼠海马神经元形态学的影响。方法:行为学测试结束后,大鼠麻醉,心脏采血,采用ELISA法测定各组大鼠血清雌二醇数值。灌注固定,断头取脑,制备标本,光镜下HE染色和透射电镜观察海马CA1区神经元细胞形态学变化。结果:1.血清雌二醇浓度的测定结果模型组大鼠血清中雌激素的浓度较假手术组和雌激素治疗组均显着降低。雌激素治疗组和假手术组比较,血清中雌激素的浓度差异无统计学意义。2.大鼠海马CA1区神经元HE染色结果假手术组大鼠海马CA1区椎体神经元细胞数量丰富,排列紧密,细胞轮廓清晰,形状规则饱满,核仁清晰,染色质分布均匀。模型组大鼠海马CA1区椎体神经元排列松散紊乱,胞体缩小,大部分胞体呈多角形或梭形,细胞核固缩深染,核仁模糊甚至完全消失,胞浆周围空晕。经雌激素治疗后的大鼠,尤其是E2-early组,海马CA1区椎体神经元细胞损伤较轻,细胞排列相对致密,细胞结构相对完整,核仁清晰,偶见核固缩的神经元。E2-later组海马CA1区神经元细胞数量减少,排列较为松散,多数细胞形态模糊,可见少部分核固缩变性的神经元。3.大鼠海马CA1区神经元超微结构改变假手术组大鼠海马CA1区神经元细胞核形态规则饱满,双层膜结构清晰,核内染色质分布均匀,胞浆内细胞器丰富,超微结构完整,只有少量神经元内可见自噬小体。模型组大鼠海马CA1区神经元细胞轮廓异型,核固缩,核周隙变大,核膜溶解内陷,核内异染色质增多,并凝集成块边聚化,胞浆内细胞器明显减少,残存的线粒体肿胀呈空泡样,粗面内质网扩张断裂,自噬小体增多。雌激素干预后,细胞核和细胞器的超微结构损伤明显减轻,细胞核形态正常,细胞器清晰。值得注意的是,与E2-early组相比,E2-later组大鼠海马CA1区神经元的超微结构损伤仍较为明显。结论:VD大鼠的海马CA1区神经元细胞出现了显着的组织病理学变化。经过雌激素治疗后,尤其是早期治疗组,海马神经元的损伤明显减轻,雌激素可能以一种治疗时间依赖的方式发挥其作用。第三部分 雌激素对血管性痴呆大鼠海马神经元凋亡和自噬相关蛋白表达的影响目的:观察VD大鼠海马组织中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3及自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin1的表达,进一步观察雌激素对神经元凋亡及自噬的调控作用,探讨雌激素发挥神经保护作用的机制。方法:1.动物分组及干预方式同第一部分。2.采用免疫组化的方法检测大鼠海马组织CA1区Bcl-2、Bax、caspase-3、Beclin1阳性细胞的表达,采用免疫荧光染色观察大鼠海马组织中LC3Ⅱ阳性细胞的表达。采用蛋白质免疫印迹技术检测大鼠海马组织中Bcl-2、Bax、caspase-3、LC3Ⅱ、Beclin1 蛋白的表达变化。结果:1 免疫组化方法检测大鼠海马Bcl-2、Bax、caspase-3、Beclin1的表达变化1.1 光镜下Bcl-2免疫阳性产物呈棕黄色颗粒,神经元胞浆和胞核均有定位。与假手术组相比,模型组海马CA1区神经元Bcl-2的IOD/area值明显降低（P<0.05）。与模型组相比,E2-early组Bcl-2的IOD/area值显着增高（P<0.05）,而E2-later组Bcl-2的IOD/area值虽较模型组有增高,但无统计学差异。1.2 光镜下Bax免疫阳性产物呈棕黄色颗粒,主要定位于神经元胞浆。与假手术组相比,模型组海马CA1区神经元Bax的IOD/area值明显增高（P<0.05）。与模型组相比,E2-early组Bax的IOD/area值显着降低（P<0.05）,而E2-later组Bax的IOD/area值虽较模型组有所降低,但无统计学差异。1.3 光镜下caspase-3免疫阳性产物为棕色颗粒,神经元胞浆及胞核均有定位。与假手术组相比,模型组海马CA1区caspase-3的IOD/area值明显增高（P<0.05）。与模型组相比,E2-early组caspase-3的IOD/area值显着降低（P<0.05）,而E2-later组caspase-3的IOD/area值虽较模型组有降低,但无统计学差异。1.4 光镜下Beclin1免疫阳性产物为棕黄色颗粒,定位于神经元胞浆。与假手术组相比,模型组海马CA1区Beclinl的IOD/area值显着增加（P<0.01）。与模型组相比,E2-early 组及 E2-later 组 Beclinl 的 IOD/area 值均显着降低（P<0.01 E2-early组vs.Model组;P<0.05 E2-later组vs.Model组）,但E2-early组与E2-later组之间差异无统计学差异。2 免疫荧光观察大鼠海马LC3Ⅱ的表达LC3Ⅱ蛋白在本实验中标记为黄绿色荧光。荧光显微镜观察假手术组神经元细胞免疫荧光表达较微弱,模型组LC3Ⅱ免疫荧光强度明显增加（P<0.01）。与模型组比较,E2-early组和E2-later组LC3Ⅱ免疫荧光表达强度均显着减少（P<0.01 E2-early 组 vs.Model 组;P<0.05 E2-later组vs.Model组）,但E2-early组与E2-later组之间差异无统计学差异。3 Western blot 结果3.1 模型组大鼠海马中Bcl-2、Bax、caspase-3、LC3Ⅱ、Beclinl蛋白的表达3.1.1 与假手术组相比,模型组Bcl-2蛋白表达量显着下降（P<0.05）,Bax蛋白、caspase-3蛋白表达量均显着升高（均P<0.05）,有统计学意义。3.1.2 与假手术组对比,模型组LC3Ⅱ蛋白及Beclin1蛋白表达量显着升高（均P<0.05）,有统计学意义。3.2 雌激素对 VD 大鼠海马 Bcl-2、Bax、caspase-3、LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表达的影响3.2.1 与模型组相比,E2-early组及E2-later组Bcl-2蛋白表达量均显着增加（均P<0.05）,Bax蛋白表达量均显着下降（均P<0.05）,caspase-3蛋白表达量均显着下降（均P<0.05）,有统计学差异。3.2.2 与模型组相比,E2-early组及E2-later组LC3Ⅱ蛋白表达量显着下降（均P<0.05）,E2-early组及E2-later组Beclin1蛋白表达量明显下降（P<0.01 E2-early组vs.Model组;P<0.05 E2-later 组 vs.Model 组）,有统计学差异。结论:VD大鼠海马神经元细胞凋亡增加及自噬被激活,导致海马神经元变性及死亡。雌激素可以通过减轻海马神经元凋亡及下调自噬的激活来改善海马损伤。第四部分 雌激素对血管性痴呆大鼠海马组织Wnt/β-catenin信号通路的影响目的:观察雌激素对VD大鼠Wnt/β-catenin信号转导通路的影响,并对其分子生物学机制进行探讨。方法:1.清洁级成年健康雌性SD大鼠48只随机分为四组:假手术组（sham组）、模型组（model组）、雌激素组（E2组）、雌激素+Wnt通路抑制剂组（E2+DKK1 组）。2.模型组大鼠仅切除卵巢周围少量脂肪组织,其余三组大鼠予OVX术。OVX术后1周,模型组、E2组、E2+DKK1组接受BCCAO手术制备VD模型,假手术组行BCCAO假手术。E2+DKK1组大鼠于BCCAO术后第一天接受侧脑室置管术。3.E2组大鼠及E2+DKK1组大鼠分别于BCCAO术后第1天开始接受17β-雌二醇腹腔注射,100 μg/kg/day,溶剂为芝麻油,假手术组大鼠和模型组大鼠分别接受等量芝麻油腹腔注射。每日1次,连续7天。重组人类DKK1蛋白用于阻断Wnt/β-catenin信号转导通路。E2+DKK1组大鼠于BCCAO术后第1天和第4天接受侧脑室注射DKK1 10 μl,浓度为1μg/μl。4.BCCAO术后7天后取材,光镜下HE染色及透射电镜观察海马CA1区神经元细胞形态学变化,免疫组化法及Western blot技术检测海马组织中β-catenin、Cyclin D1、GSK-3β 的蛋白表达。结果:1.光镜下大鼠海马CA1区神经元HE染色结果假手术组大鼠海马CA1区神经元细胞排列致密有序,胞核规则饱满,核仁清晰。模型组大鼠海马CA1区神经元排列紊乱,胞体缩小呈梭形或多角形,胞核深染、固缩,核仁消失。E2组大鼠海马CA1区神经元损伤明显减轻,神经元排列整齐,大部分细胞形态清晰,少部分神经元细胞形态模糊,偶见核固缩的神经元。E2+DKK1组大鼠海马CA1区神经元排列松散紊乱,大部分神经元细胞形态模糊,胞核形状不规则,深染、固缩,胞浆周围发现空晕,胞间距较大。2.透射电镜下大鼠海马CA1区神经元超微结构的改变假手术组大鼠海马CA1区神经元细胞核形态规则饱满,双层膜结构清晰,核内染色质分布均匀,胞浆内细胞器丰富,超微结构完整。模型组大鼠海马CA1区神经元细胞轮廓异型,核固缩,核周隙变大,核膜溶解内陷,核内异染色质增多,并凝集成块边聚化,胞浆内细胞器溶解消失。E2组大鼠海马CA1区神经元细胞核形态正常,双层核膜模糊,胞浆内细胞器虽然较丰富,但内质网明显扩张,高尔基体及线粒体均明显肿胀。E2+DKK1组大鼠海马CA1区神经元固缩,形态不规则,核膜溶解断裂,核内异染色质增多,并凝集成块边聚化,胞浆内细胞器明显减少,糖原颗粒消失,线粒体消失,残存的内质网及高尔基体明显扩张。3免疫组化法观察大鼠海马β-catenin、Cyclin D1及GSK-3β的表达3.1光镜下β-catenin免疫阳性产物呈棕黄色颗粒,定位于神经元胞浆。模型组大鼠海马CA1区β-catenin的IOD/area值较假手术组显着降低（P<0.05）。经过雌激素治疗后,E2组较模型组的β-catenin的IOD/area值显着增高（P<0.05）,而给予Wnt通路抑制剂后,E2+DKK1组与模型组相比较,β-catenin的IOD/area值虽有所增高,但无统计学差异,E2+DKK1组的IOD/area值较E2组显着降低（P<0.05）。3.2光镜下GSK-3β免疫阳性产物呈棕黄色颗粒,定位于神经元胞浆。模型组大鼠海马CA1区GSK-3β的IOD/area值较假手术组显着增高（P<0.01）。经过雌激素治疗后,E2组较模型组的GSK-3β的IOD/area值显着降低（P<0.01）,而给予Wnt通路抑制剂后,E2+DKK1组与模型组相比较,GSK-3β的IOD/area值虽有所降低,但无统计学差异,E2+DKK1组的IOD/area值较E2组显着增加（P<0.05）。3.3光镜下Cyclin D1免疫阳性产物呈棕黄色颗粒,定位于神经元胞浆。模型组大鼠海马CA1区Cyclin D1的IOD/area值较假手术组显着降低（P<0.01）。经过雌激素治疗后,E2组较模型组的Cyclin D1的IOD/area值显着增加（P<0.01）,而给予Wnt通路抑制剂后,E2+DKK1组与模型组相比较,CyclinD1的IOD/area值虽略所增加,但无统计学差异,E2+DKK1组的IOD/area值较E2组显着降低（P<0.01）。4 Western blot 结果4.1 模型组:与假手术组相比,大鼠海马组织β-catenin蛋白表达量均显着减少（P<0.05）,Cyclin D1蛋白表达量显着减少（P<0.01）,GSK-3β蛋白表达量显着增加（P<0.01）。4.2 E2组:与模型组比较,经雌激素干预治疗后,这种趋势得到了明显逆转,β-catenin蛋白表达量显着增加（P<0.05）,Cyclin D1蛋白表达量显着增加（P<0.01）,GSK-3β蛋白表达量显着减少（P<0.01）。4.3 E2+DKK1组:与单独给予雌激素治疗相比,同时给予DKK1,大鼠β-catenin蛋白表达量显着减少（P<0.01）,Cyclin D1蛋白表达量显着减少（P<0.05）,GSK-3β蛋白表达量显着增加（P<0.05）。结论:雌激素治疗可减轻VD大鼠海马神经元损伤,给予Wnt通路抑制剂DKK1,使得雌激素的保护作用明显减弱,表明雌激素可能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路发挥其作用。第五部分 雌激素替代治疗对手术绝经患者术后认知功能的影响目的:探究雌激素替代治疗对手术绝经患者术后认知功能的影响。方法:选取河北省人民医院妇科2019年1月至2020年1月收治的42例因良性病变行子宫及双侧卵巢切除患者为研究对象（术前均未绝经）,年龄48～54岁,分为两组,实验组为自愿接受雌激素治疗的患者22例,给予戊酸雌二醇片口服6个月;对照组20例,不接受激素治疗。比较用药后6个月两组患者血清雌二醇水平及认知功能变化。结果:治疗后实验组患者血清雌二醇水平较对照组显着增加（P<0.05）,蒙特利尔认知评估量表（Montreal cognitive assessment,MoCA）评分较对照组显着增加（P<0.05）。结论:雌激素替代治疗有助于改善手术绝经患者术后认知功能。
张智慧[4]（2021）在《针刺调控神经细胞自噬与凋亡以延长脑梗死溶栓时间窗的研究》文中指出目的:明确针刺早期干预对延长脑梗死溶栓时间窗的效应,基于“自噬凋亡共同影响缺血半暗带神经细胞死亡进程”理论,探讨针刺延长脑梗死溶栓时间窗的作用机制。方法:采用SPF级SD大鼠,以改良的自体血栓栓塞模型作为脑梗死研究对象,使用rtPA为静脉溶栓药物,“醒脑开窍”针刺法为干预手段。分为实验一与实验二两部分。实验一、针刺延长脑梗死溶栓时间窗的效应研究:将80只SD大鼠随机分组为假手术组、模型组、4.5h溶栓组组、6h溶栓组、7.5h溶栓组、针刺+4.5h溶栓组、针刺+6h溶栓组、针刺+7.5h溶栓组。观察早期针刺干预对各组大鼠脑梗死体积、神经行为学评分、颅内溶栓出血性转化及脑水肿的影响,以明确针刺延长脑梗死溶栓时间窗的效应。实验二、针刺调控自噬凋亡交互作用延长脑梗死溶栓时间窗的机制研究:在明确针刺延长脑梗死溶栓时间窗效应后,将50只SD大鼠随机分组为假手术组、模型组、6h溶栓组组、针刺+6h溶栓组;采用Western blot、Real time-PCR检测不同组间自噬标志蛋白LC3、Beclin1及p62的表达情况。分组不变,采用Western blot观察不同组别抗凋亡蛋白Bcl2和促凋亡蛋白Bax的表达情况,并观察Bc12/Beclin1、Bcl2/Bax 比值变化,以明确针刺延长脑梗死溶栓时间窗的作用机制。结果:（1）各组大鼠神经行为学评分:治疗后24h评分,与模型组比较,4.5h溶栓组神经行为学评分降低（P<0.05）,而时间窗外溶栓组,6h溶栓组、7.5h溶栓组行为学评分差异无统计学意义（P>0.05）。与模型组、6h溶栓组相比,针刺+6h溶栓组神经行为学评分均降低（P<0.05）。但针刺+7.5h溶栓组与模型组、7.5h溶栓组相比,神经行为学评分均差异无统计学意义（P>0.05）。表明针刺可以改善溶栓时间窗外（6h）溶栓大鼠的神经行为学评分。（2）各组大鼠脑梗死体积百分比:与模型组相比,4.5h溶栓组、针刺+4.5 h溶栓组、针刺+6h溶栓组脑梗死体积缩小（P<0.05）。针刺+6h溶栓组与6h溶栓组比,梗死体积缩小（P<0.05）。表明针刺可减少时间窗外（6h）溶栓大鼠的脑梗死体积。（3）各组大鼠脑出血性转化:与模型组相比,6h溶栓组、7.5h溶栓组、针刺+7.5h溶栓组血红蛋白含量均升高（P<0.05）,说明超时间窗外溶栓会增加出血性转化风险。针刺+6h溶栓与6h溶栓比,血红蛋白含量降低（P<0.05）。表明针刺可降低时间窗外（6h）溶栓大鼠的脑出血性转化。（4）各组大鼠脑含水量:与模型组相比,4.5h溶栓组、针刺+4.5h溶栓组、针刺+6h溶栓组脑含水量均降低（P<0.05）;而时间窗外6h溶栓组、7.5溶栓组脑含水量均增加（P<0.05）。针刺+6h溶栓组与6h溶栓组比,脑含水量降低（P<0.05）。表明针刺可降低时间窗外（6h）溶栓大鼠的脑含水量。（5）各组大鼠神经细胞自噬水平的表达:①WB结果显示:与假手术组比,各组Beclin1、LC3蛋白表达水平上升（P<0.05）,而p62各组蛋白表达水平下降（P<0.05）。与模型组相比,6h溶栓组Beclin1、LC3、p62表达无统计学差异（P>0.05）,针刺+6h溶栓组Beclin1、LC3表达上升,p62表达下降（p<0.05）。与6h溶栓组相比,针刺+6h溶栓组Beclin1、LC3表达上升,p62表达下降（p<0.05）。②RT-PCR结果显示:与假手术组相比,各组Beclin1、LC3 mRNA的表达水平上升,p62 mRNA表达下降（p<0.05）。与模型组相比,6h溶栓组和针刺+6h溶栓组Beclin1、LC3 mRNA的表达上升,针刺+6h溶栓组p62 mRNA的表达下降（p<0.05）。与6h溶栓组相比,针刺+6h溶栓组Beclin1、LC3 mRNA的表达上升,p62表达下降（p<0.05）。表明针刺可上调时间窗外溶栓大鼠自噬标志物Beclin1、LC3,并下调溶酶体标志物p62的蛋白和mRNA表达水平,进而适度激活细胞自噬。（6）各组大鼠神经细胞凋亡水平的表达:①WB结果显示:与假手术组相比,模型组、6h溶栓组、针刺+6h溶栓组Bc12、Bax表达均上升（p<0.05）。与模型组相比,6h溶栓组Bcl2、Bax表达无统计学差异（p>0.05）,但针刺+6h溶栓组Bcl2表达上升,Bax表达下降（p<0.05）。与6h溶栓组相比,针刺+6h溶栓组Bcl2表达上升,Bax表达下降（p<0.05）。②RT-PCR结果显示:与假手术组相比,模型组、6h溶栓组、针刺+6h溶栓组Bcl2、Bax mRNA表达均上升（p<0.05）。与模型组相比,6h溶栓组Bcl2、Bax表达无统计学差异（p>0.05）,但针刺+6h溶栓组Bcl2表达上升,Bax表达下降（p<0.05）。与6h溶栓组相比,针刺+6h溶栓组Bcl2表达上升,Bax表达下降（p<0.05）,表明针刺可上调时间窗外溶栓大鼠抗凋亡Bcl2蛋白和mRNA表达水平,下调促凋亡Bax蛋白和mRNA表达水平,进而抑制凋亡。（7）各组大鼠神经细胞中Bcl2/Beclin1和Bcl2/Bax 比值的表达:通过比值比较,与假手术组相比,模型组Bc12/Beclin1比值上调、Bcl2/Bax比值下调,6h溶栓组、针刺+6h溶栓组Bc12/Beclin1 比值下调、Bcl2/Bax比值上调（p<0.05）;与模型组相比,6h溶栓组、针刺+6h溶栓组Bc12/Beclin1 比值下调,Bcl2/Bax比值上调（p<0.05）。与6h溶栓组相比,针刺+6h溶栓组Bc12/Beclin1 比值下调、Bcl2/Bax比值上调（p<0.05）。结论:（1）针刺及时介入可减轻脑梗死溶栓并发症,并延长安全溶栓时间窗至6h;（2）针刺延长脑梗死溶栓时间窗的作用是通过适度激活脑梗死溶栓后缺血半暗带神经细胞自噬并抑制凋亡的机制而实现。
张华朋[5]（2020）在《PI3K/Akt通道在七氟烷后处理脑缺血糖尿病大鼠神经保护作用的研究》文中研究表明研究背景脑卒中（cerebral stroke）是各种诱发因素导致脑内动脉闭塞、破裂而造成脑部血液循环障碍而引起脑组织损伤的一组疾病,分为缺血性、出血性两种。脑卒中作为世界上致死率最高的疾病之一,全球每年新发病例高达1030万,且近来有年轻化的趋势,给社会、家庭和患者带来极大的负担。更严重的是,许多其他疾病会直接或间接导致脑卒中的发生。例如糖尿病就是引起脑血管疾病的独立危险因素,据国外资料显示,有糖尿病史患者同时患脑血管疾病的概率达到了 30～40%,而且糖尿病合并脑卒中的患者已经达到非糖尿病患者的2倍以上。临床上糖尿病合并脑卒中的患者中缺血性脑卒中占到了 80%,糖尿病并发卒中的发病率快速上升。因此如何设计和开发安全有效的脑卒中治疗药物,尤其是糖尿病脑卒中是一个亟待解决的问题。众多研究资料表明,吸入性麻醉药预处理或后处理可以保护神经系统减轻缺血性损伤。有学者发现七氟烷预处理能够减少动脉阻塞导致的脑梗死体积和凋亡细胞。许多脑缺血再灌注损伤动物模型实验证明,七氟烷预处理可以有效减少神经细胞的凋亡、一定程度改善脑梗死体积、神经功能评分、炎性反应等方面从而保护脑神经。但我们并不清楚糖尿病是否会影响七氟烷后处理的神经保护作用,且七氟烷发挥作用的机制也有待研究。有学者发现糖尿病大鼠通过恢复海马突触功能和Na+,K+-ATP酶的活性提高学习和记忆能力,机制可能与PI3K/Akt信号通道有关;Yang和同事发现利拉鲁肽可以激活糖尿病大鼠PI3K/Akt信号通道,促进自噬,最终对慢性2型糖尿病相关的学习记忆障碍提供保护;另有研究已经证实糖尿病大鼠大脑皮层细胞中PI3K/Akt信号通道相关蛋白的表达量明显下降。因此,有必要进行七氟烷对糖尿病大鼠脑缺血后神经损伤影响的研究,以期发现七氟烷后处理对脑缺血再灌注糖尿病大鼠神经功能损害是否有效,以及PI3K/Akt信号通道在七氟烷后处理中的作用机制,为后期降低糖尿病人群脑缺血后神经功能损害及促进脑卒中后神经功能恢复提供理论依据。研究目的本文通过构建脑缺血合并糖尿病大鼠模型,评估七氟烷后处理对合并糖尿病的大鼠在脑缺血再灌注后,脑组织损伤程度及氧化应激和细胞凋亡的影响,以及PI3K/Akt信号通道在七氟烷后处理中的作用机制做初步探究。研究方法1.研究对象及分组:健康Wistar大鼠288只,体重（260±30）g。大鼠饲养于室温20±2℃,相对湿度50%～70%的清洁环境中,自由摄食、摄水,适应性饲养一周后,进行实验分组和脑缺血糖尿病模型制备。首先取其中240只大鼠随机分为6组（每组40只）,正常组（Control）:不做处理;糖尿病组（DM）:选取糖尿病造模成功后大鼠;脑缺血模型组（CI）:采用线栓法将健康大鼠大脑中动脉血流阻断2h后恢复灌注;糖尿病脑缺血模型组（DMCI）:阻断糖尿病大鼠大脑中动脉血流2h后恢复灌注;七氟烷后处理组（SCI）:健康大鼠缺血再灌注开始时立即给予大鼠2.6%的七氟烷吸入,持续30min;糖尿病七氟烷后处理组（SDMCI）:糖尿病大鼠缺血再灌注开始时立即给予大鼠2.6%的七氟烷吸入,持续30min。Control、DM、CI和DMCI组大鼠均在再灌注开始时给予100%氧气,持续30 min,大鼠再灌注24h后进行相应指标检测。2.建立糖尿病和脑缺血大鼠模型:大鼠高脂高糖饮食,喂养5周后,腹腔注射STZ（链脲佐菌素,Streptozotocin,溶解于柠檬酸缓冲液中,25mg/kg）每天一次,连续2d。72h后尾静脉采血测空腹血糖,以血糖≥16.7mmol/L,并出现多食、多尿、多饮为大鼠糖尿病模型成立。脑缺血大鼠模型构建方法:大鼠术前12h禁食。腹腔内注射10%水合氯醛麻醉大鼠,仰卧位固定,手术暴露右颈总动脉,在分叉处分离颈内动脉和颈外动脉,用4/0尼龙线阻断大脑中动脉,2h后抽出尼龙线,开放大脑中动脉,恢复缺血区灌注。模型成功建立的标志是:大鼠手术后清醒,左侧肢体出现偏瘫,以左上肢较为明显;提尾悬挂时左上肢呈现蜷缩屈曲;下地行走时向左侧转圈跌倒,不能正常直行。3.LY294002脑室内注射给药:为了研究七氟烷治疗脑缺血再灌注中PI3K/Akt通道的作用,用PI3K/Akt特异性抑制剂LY294002预处理七氟烷治疗组大鼠。取其余48只大鼠,将大鼠分为6组（每组8只）,分别构建正常脑缺血加生理盐水组（NS-CI）、糖尿病合并脑缺血加生理盐水组（NS-DMCI）,七氟烷后处理脑缺血加生理盐水组（NS-SCI）、七氟烷后处理糖尿病脑缺血加生理盐水组（NS-SDMCI）、七氟烷后处理脑缺血加抑制剂组（LY-SCI）、七氟烷后处理糖尿病脑缺血加抑制剂组（LY-SDMCI）大鼠模型。术前将LY294002溶于二甲基亚砜（DMSO）和乙醇中,终浓度为10mM。将大鼠用10%水合氯醛（350mg/kg,腹腔给药）麻醉。LY-SCI组和LY-SDMCI组在建立缺血模型术前30min,在缺血侧脑室注射10μl LY294002溶液,其他组大鼠麻醉后侧脑室注射10μl生理盐水作为对照。NS-SCI组、NS-SDMCI组、LY-SCI组、LY-SDMCI组缺血2h后恢复灌注时给予给予大鼠2.6%的七氟烷吸入,持续30min:NS-CI组、NS-DMCI组再灌注开始时给予100%氧气,持续30min。4.指标检测:对于神经功能评估,采用Longa的5级4分法,在动物麻醉清醒后24h进行评分并记录神经功能缺失症状;对于脑梗塞体积评估,采用TTC染色法并利用ImageJ软件进行计算;通过计算脑组织干/湿重比值评估大鼠脑水肿程度;对于大鼠大脑组织形态学变化,采用HE染色在光学显微镜下进行观察;对于大鼠神经学习能力的检测,采用Morris水迷宫实验进行测定;对于大鼠血清中的 S100B、Bcl-2、Bax、GSH-PX、Caspase-3 和 SOD 的含量,采用 ELISA试剂盒进行检测;对于大鼠血清中NOS活性和NO含量,采用比色法进行检测;western blot检测脑组织中PI3K/Akt通道相关蛋白的磷酸化水平。5.统计学方法分析:应用SPSS19.0统计学软件对各项检测数据进行数据分析,所有分析数据结果均以均数±标准差（mean±SD）表示,两组间数据分析采用t检验,多组间数据分析采用单因素方差分析（ANOVA）,事后分析采用LSD-t检验,两组间数据采用双变量Pearson进行相关性分析,以P<0.05表示差异具有统计学意义。研究结果1.七氟烷后处理可以减弱大鼠缺血性脑损伤。各脑缺血组大鼠与Control组相比脑梗死体积、Longa神经缺陷评分和脑含水量均增加（P<0.05）,且DMCI组大鼠的上述指标较CI和DM组大鼠有进一步增加（P<0.05）。七氟烷治疗降低了 SCI和SDMCI组的脑梗死体积、Longa分值和脑含水量（P<0.05）。结果表明七氟烷后处理减弱了 SCI和SDMCI组大鼠的缺血性脑损伤,对神经系统有保护作用。2.七氟烷后处理能改善脑缺血糖尿病大鼠的空间学习和记忆能力。利用Morris水迷宫来评估大鼠的空间学习和记忆功能,结果显示与Control组相比,其他脑缺血组别的大鼠逃避潜伏期时间明显延长,穿越平台次数显着降低（P<0.05）。而相比于CI和DMCI组,再灌注开始时吸入七氟烷的大鼠（SCI组和SDMCI组）逃避潜伏期时间明显减少,穿越平台次数显着增加（P<0.05）,并且可以在更短的时间内在导航测试中找到平台（P<0.05）。这些结果表明:七氟烷后处理改善了脑缺血糖尿病大鼠的空间学习和记忆能力。3.七氟烷后处理减轻了脑缺血糖尿病大鼠的脑组织形态学损伤。HE染色结果显示,对照组的大鼠脑组织由健康神经细胞组成,没有细胞肿胀、膜起泡、核浓缩、破碎溶解。与Control组和DM组相比,CI组的大鼠脑组织切片显示出坏死,神经元丢失,核固缩,神经元收缩和星形细胞肿胀。此外,与CI组相比,DMCI组显示出更严重的损伤。经过七氟烷后处理后,SCI组和SDMCI组的大鼠的组织损伤有明显的改善。4.七氟烷后处理减少脑缺血糖尿病大鼠的氧化应激反应。为了探究七氟烷的神经保护作用是否与其抗氧化特性有关,我们检测了内源性抗氧化酶SOD和GSH-PX的活性,以及NOS和NO的水平。与Control组相比,CI组的SOD和GSH-PX水平降低（P<0.05）,而DMCI组中二者表达水平进一步降低（P<0.05）。与CI和DMCI组相比,SCI和SDMCI组中SOD和GSH-PX含量明显增加（P<0.05）。七氟烷可以显着增加SCI和SDMCI组的大鼠的SOD和GSH-PX的表达。另一方面,NOS和NO的表达水平在CI组中有所增加（P<0.05）,并在DMCI组中进一步增加（P<0.05）,但经七氟烷后处理二者的表达水平显着降低（P<0.05）,这些结果表明七氟烷可以防御SCI和SDMCI组中大鼠的氧化损伤。5.七氟烷后处理可减弱脑缺血糖尿病大鼠脑组织的细胞凋亡。缺血再灌注后,血清中促凋亡因子Bax和Caspase-3在CI和DMCI组中的表达上调（P<0.05）,但在七氟烷治疗组中表达下调（P<0.05）。另一方面,抗凋亡因子Bcl-2的表达水平在CI组相比于Control组有所降低（P<0.05）,在DMCI组中Bcl-2的表达水平进一步降低（P<0.05）。与CI和DMCI组相比,七氟烷可以显着提高Bcl-2的表达（P<0.05）。这些结果表明:七氟烷通过在脑缺血大鼠脑组织中抑制细胞凋亡来减轻缺血性脑损伤。6.七氟烷后处理组大鼠的S100B蛋白水平显着降低。相比与对照组,各脑缺血组大鼠血清中S100B的浓度显着升高（P<0.05）,且DMCI组S100B的含量高于CI组和DM两组（P<0.05）,表明合并糖尿病可以加重大鼠缺血后再灌注造成的脑损伤。经七氟烷吸入治疗后,与CI和DMCI组相比,SCI和SDMCI组的S100B水平明显降低（P<0.05）。7.S100B蛋白水平与氧化损伤指标的相关性分析显示:S100B蛋白表达量与Longa神经功能缺陷评分、脑梗死体积、含水量、NOS、NO、Bax和Caspase-3呈正相关（P<0.01）,与SOD、GSH-PX和Bcl-2呈负相关（P<0.01）。说明血清S100B可以作为评价大鼠脑缺血损伤的可靠指标,提示七氟烷后处理可以减轻大鼠脑缺血引起的脑损伤程度。8.七氟烷后处理显着增加PI3K/Akt通道活性。Western blot实验结果显示脑缺血大鼠中PI3K和Akt蛋白的磷酸化水平与Control组相比明显降低（P<0.05）,DMCI组大鼠p-PI3K、p-Akt的含量低于CI组和DM组（P<0.05）。而与CI和DMCI组相比,用七氟烷后处理后,p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的比例明显增加（P<0.05）。表明七氟烷可能通过PI3K/Akt信号通道的激活来发挥作用。9.阻断PI3K/Akt信号通道可以减弱七氟烷对氧化应激和凋亡的保护作用。用PI3K/Akt通道抑制剂LY294002注射大鼠,检测血清中氧化应激和细胞凋亡相关因子水平的变化。七氟烷可以使脑缺血和糖尿病合并脑缺血的大鼠血清促凋亡因子Bax、Caspase-3水平降低（P<0.05）,并可以使凋亡抑制因子Bcl-2的蛋白含量升高（P<0.05）;当同时用LY294002处理大鼠后,七氟烷的作用变得不明显,血清Bax、Caspase-3、Bcl-2的含量与处理前变化不大（P<0.05）。类似地,脑缺血与糖尿病合并脑缺血的大鼠再灌注开始时吸入七氟烷可以改善缺血引起的抗氧化因子SOD和GSH-PX水平下降（P<0.05）,使它们的表达量大幅度升高;且代表氧化程度的NOS和NO水平与未经七氟烷处理的大鼠相比较也有所下降（P<0.05）。而LY294002的引入减弱了七氟烷的这种治疗效果,使血清SOD、GSH-PX、NOS和NO的含量均接近未吸入七氟烷治疗的缺血再灌注大鼠（P<0.05）。说明阻断PI3K/Akt信号通道可以抑制七氟烷的治疗效果,进一步验证了七氟烷是通过激活PI3K/Akt通道发挥保护作用。结论七氟烷后处理可显着改善糖尿病大鼠缺血再灌注时造成的脑损伤并很可能通过激活PI3K/Akt信号通道,抑制脑神经元细胞内的氧化应激反应和细胞凋亡从而发挥对大鼠脑缺血性神经损伤的保护作用。
孙大伟[6]（2020）在《全脑缺血再灌注损伤后神经保护新策略及其机制研究》文中研究表明目的:全脑缺血再灌注损伤将导致神经凋亡和神经功能损伤,通常可发生于心跳骤停、休克、体外循环、创伤性大出血和窒息等情况,而自噬在此过程中扮演着重要的角色,本文旨在建立全脑缺血再灌注模型后使用药物治疗脑神经元损伤,并对其机制进行研究探讨。方法:（1）通过大鼠双侧颈总动脉夹闭复合低血压法建立短时全脑缺血再灌注模型（t GCI）,给予碱性成纤维生长因子（b FGF）后通过分子生物学以及行为学方法检测是否改善脑损伤,并进一步探讨其中的机制;（2）建立窒息性心跳骤停-心肺复苏模型（CA-ROSC）来模拟临床上心跳骤停情况,并将HIF-1a抑制剂2ME2制成ANG-PEG-2ME2/2ME2纳米胶束,靶向穿透血脑屏障（BBB）,评估药物在脑中吸收情况,检测凋亡相关蛋白以及用组织化学法分析脑损伤改善程度,评测神经功能缺损评分;（3）通过分子生物学方法检测CA-ROSC后自噬和溶酶体相关蛋白表达,检测自噬流完整性,并抑制ROS后观察溶酶体蛋白以及自噬流的变化。结果:（1）t GCI损伤后可通过m TOR途径激活自噬,并通过p53线粒体转位在海马CA1区诱导凋亡产生,过量的自噬将导致进一步的脑损伤,而脑室注射b FGF可以抑制过度的自噬和细胞凋亡,发挥神经保护作用,并改善记忆功能;（2）ANGPEG-2ME2/2ME2胶束可以顺利地穿透血脑屏障到达受损的脑区,并减少CAROSC后受损区域的凋亡发生,增加活性神经元数目,最终改善神经功能缺损评分;（3）CA-ROSC后溶酶体相关蛋白表达下降,LC3-II、Beclin-1等自噬相关蛋白增加,但p62也增加,自噬流受损,而抑制过度产生的ROS可以改善溶酶体受损的程度,从而减轻自噬流受损程度。结论:通过建立t GCI和CA-ROSC等全脑缺血再灌注模型,研究了自噬在缺血再灌注后脑损伤中的相关作用;b FGF可通过抑制过度自噬和凋亡在全脑缺血再灌注后脑损伤中起保护作用;ANG-PEG-2ME2/2ME2可以高效地透过血脑屏障并扩散到受伤的大脑区域,优于游离的2ME2,并且对CA后的脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用;心跳骤停-心肺复苏后受损后皮层神经元自噬流阻断、溶酶体受损,抑制ROS后可减轻此趋势。
郭雨萱[7]（2020）在《PHLDA1在H2O2诱导的H9c2心肌细胞损伤和心肌缺血再灌注损伤中的机制研究》文中研究表明目的:在心血管疾病中,由于心肌缺血再灌注造成的死亡占很大比例。其中,在再灌注过程中,会观察到氧化应激损伤的产生。在缺血/再灌注模型中观察到,当系统无法在氧化剂分子的生产和利用之间建立平衡时,会产生氧化应激。氧化应激过程中活性氧（reactive oxygen species,ROS）的过量产生导致蛋白质,DNA和脂质损伤,引起细胞损伤。PHLDA1首先在T细胞受体激活诱导的细胞凋亡中被鉴定出来,目前的研究表明PHLDA1在不同的细胞种类和刺激下起到不同的作用,目前关于PHLDA1在氧化应激诱导的心肌细胞（H9c2）损伤和心肌缺血再灌注损伤中的作用尚未报道。本研究主要探究PHLDA1在氧化应激诱导的心肌细胞损伤和心肌缺血再灌注损伤中的作用,以及PHLDA1通过结合Bax在氧化应激诱导的心肌细胞损伤中的作用机制。研究方法:1、培养H9c2心肌细胞,分别用不同浓度的H2O2处理细胞。CCK8实验观察细胞活力、流式细胞术检测细胞凋亡。用Western blot检测PHLDA1蛋白和凋亡相关蛋白caspase 3,PARP1的表达水平。筛选合适药物浓度用于后续试验。300μM H2O2处理H9c2不同时间。Western blot检测PHLDA1蛋白的表达水平。筛选合适药物刺激时间用于后续试验。2、在H9c2细胞中转染Flag-PHLDA1质粒和对照组质粒,转染46h后300μM H2O2处理或者不处理H9c2 90min,CCK8实验观察细胞活力变化,流式细胞术检测细胞凋亡变化,Western blot检测Flag-PHLDA1蛋白和凋亡相关蛋白caspase 3、PARP1的表达水平,JC-1检测试剂盒检测线粒体膜电位的改变,ROS检测试剂盒检测细胞内ROS的改变。3、在H9c2心肌细胞中转染对照siRNA和PHLDA1 siRNA,300μM H2O2处理或者不处理H9c2 90min,CCK8实验观察细胞活力变化,流式细胞术检测细胞凋亡变化,Western blot检测PHLDA1蛋白和凋亡相关蛋白caspase 3、PARP1的表达水平,JC-1检测试剂盒检测线粒体膜电位的改变,ROS检测试剂盒检测细胞内ROS的改变。4、对SD雄性大鼠进行尾静脉注射对照shRNA和PHLDA1 shRNA腺病毒,注射3周后分别进行单纯灌流（对照组）和缺血再灌注（IR）处理,HE染色检测心肌形态变化,TTC检测心肌梗死面积变化,TUNEL染色检测心肌凋亡率变化,Western blot检测PHLDA1和PARP1的表达水平,免疫组化检测caspase 3的表达水平。5、内外源免疫共沉淀实验检测PHLDA1与Bax结合,并在H2O2刺激下结合变化。在H9c2心肌细胞中过表达、敲减PHLDA1后,心肌敲除PHLDA1后,Western blot检测Bax的表达水平。6、Western blot检测PHLDA1影响Bax的表达水平的途径。结果:1、不同浓度H2O2刺激H9c2心肌细胞,随着刺激浓度的增加,细胞活性下降、凋亡率逐渐上升,凋亡相关蛋白和PHLDA1的表达增加。随着刺激时间的延长,PHLDA1的表达增加。2、H9c2心肌细胞中过表达PHLDA1,与转染空载组相比,过表达PHLDA1并给予H2O2刺激后,细胞活性,凋亡率下降,凋亡相关蛋白的表达增加,线粒体膜电位降低更明显,活性氧的产生更多。3、H9c2心肌细胞中敲减PHLDA1,与转染NC组相比,敲减PHLDA1并给予H2O2刺激后,细胞活性,凋亡率上升,凋亡相关蛋白的表达减少,线粒体膜电位降低得到抑制,活性氧的产生减少。4、心肌组织中敲低PHLDA1,与注射NC组相比,敲减PHLDA1并给予缺血再灌注损伤,心肌形态得到维持,心肌梗死面积减少,凋亡蛋白的表达减少,凋亡率减少。5、免疫共沉淀实验验证Bax与PHLDA1结合,并在氧化应激条件下结合增强。6、MG132消除了PHLDA1对Bax蛋白的降解,CHX抑制蛋白质转录,敲低PHLDA1使Bax降解更快。结论:1、氧化应激引起的H9c2心肌细胞损伤和心肌缺血再灌注损伤中,PHLDA1表达增加。2、PHLDA1在氧化应激诱导的H9c2心肌细胞损伤和心肌缺血再灌注损伤中起到促进作用。3、PHLDA1与Bax结合参与氧化应激诱导的H9c2心肌细胞损伤。同时PHLDA1通过蛋白酶体途径引起Bax的变化。
梁克山[8]（2019）在《P38MAPK抑制剂、雌二醇和TPX2对痴呆鼠模型海马神经细胞损害的保护作用及认知功能的影响》文中研究指明引言痴呆是以认知功能进行性减退为特征的综合征,是一种渐进的、退化的脑部疾病,导致认知和情感功能的丧失,最常见于记忆,而其他功能如语言、行为以及最显着的执行功能也常常受损。据估计,全世界约有2400万人患有痴呆症,到2040年,这一数字将增加3至4倍。大约60%是阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）,10%～20%为血管性痴呆（vascular dementia,VaD）,分别占痴呆的第一、二位,其发病机制尚未完全明了。AD特征性病理改变为颞叶海马出现β淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结,VaD是由于缺血、出血、低灌注、栓塞、小血管病等血管因素及事件致认知领域损害。在影像学方面,AD是以海马、颞、顶叶皮质萎缩为主的弥漫性萎缩,VaD表现为认知相关区（额叶、颞叶、海马、顶叶、角回、丘脑等）的血管事件（梗死、出血、脑白质病变、腔隙性梗死）。除家族史和一些躯体疾病外,导致痴呆的危险因素主要有:年龄、性别、较低教育、经济水平等。两者在临床表现上各有特点。但在临床实际工作中常难以鉴别。有证据表明,相当部分的AD具有脑血管方面的病理改变,这可能是老龄化的表现之一,也有可能是AD与VaD混合状态的表现之一。同样地,VaD患者脑组织病理检查可以发现诸如老年斑之类AD改变,这可能是混合性痴呆的结果,与正常的老年化进程有关。这就导致人们对这两种疾病的关系和鉴别产生了浓厚的兴趣,这些问题的研究有助于对痴呆发生的病理机制有更加深人的了解,对临床干预策略的制定有很大的推动作用。海马是神经系统中与人类的学习与记忆关系密切的重要功能区,大脑的海马体不但是老年痴呆最早最重要的病变区域,而且也是血管性痴呆的重要受损部位,以往的研究表明,海马神经元凋亡在AD和VaD的发病中均起着重要的作用,并且对缺血低灌注损伤具有明显的易感性。阿尔茨海默氏病（阿尔茨海默病）是一种进行性神经退行性疾病,最终导致神经元不可逆性损伤以及各种智力缺陷,包括认知和记忆。AD已成为重要的公共卫生问题,其症状主要包括躯体、认知、情绪功能的障碍,以及长期的认知和感觉功能退化,这些均明显影响患者的生活质量。当前已有大量有关AD发生和发展方面的研究,并已取得显着成绩,但是这些研究仍然无法提供有效的疾病诊断和治疗技术。这种紧迫的需求激发了神经科学界及医疗行业对AD治疗方法发展的兴趣。根据经典的淀粉样蛋白假说,相对于其他各种淀粉衍生物,Aβ1-42在AD的发病中起着重要的作用。Aβ1-42是由淀粉样前体蛋白（APP）裂解产生的β-分泌酶和γ-分泌酶。Aβ蛋白过量导致淀粉样斑块的形成和各种神经功能障碍包括炎性级联反应的激活启动,tau蛋白磷酸化的推广,氧化应激的增加,细胞内的信号转导通路的管制,突触可塑性的损伤及诱导神经元的凋亡和细胞死亡。越来越多的证据表明,雌二醇可能既促进又会损害记忆相关的过程,因此,雌激素在AD病理过程中所扮演的确切的角色仍然是难以捉摸的。目前,通过向脑内立体定向注射Aβ1-42建立AD小鼠模型。切除小鼠双侧卵巢来观察17β-雌二醇（E2）对AD不同阶段的治疗（早期和晚期）的影响,国内外少见报道,对这一课题的进一步研究无疑具有重要意义。充分证据表明,妇女绝经后循环系统中雌激素水平会突然下降,造成氧化应激风险加大和神经退行过程加快,尤其是那些AD的高危人群。另一方面,实验研究表明,雌性动物（OVX）切除卵巢后的雌激素治疗可改善其学习和记忆过程,提高其在旋臂迷宫和对象识别中的认知能力。在临床情况下,绝经后5年内保持较高雌二醇水平的女性与保持稳定低雌二醇水平的女性相比,前者表现出更优的行为能力。此外,具有较高内源性雌激素水平的绝经后妇女在斯特鲁普任务和空间工作记忆,延迟回忆和数字排序测试方面的能力更为出色。同样,正在服用激素替代疗法的妇女在非空间工作记忆和空间工作记忆任务有更好的反应。然而,也有报道指出雌激素对绝经后妇女认知能力的负面影响。旨在了解这些差异的研究结果表明,若提前应用雌二醇,暴露于Aβ蛋白的神经元所受损伤会显着减少,而若同时或于暴露Aβ蛋白5天后应用雌二醇,神经元则无法获得雌二醇所带来的保护,甚至所受损伤会转而加剧。总之,在阿尔茨海默病的病理过程中雌激素起着微妙又重要的作用,可在不同阶段施加积极或消极的影响。因此,本实验通过研究AD不同病理阶段的17β-雌二醇（E2）治疗（早期和晚期）,全面了解E2在AD病理过程中的角色和评估E2作为预防药物的意义。海马是神经系统中与人类的学习与记忆关系密切的重要功能区,大脑的海马体不但是老年痴呆最先最重要的病变区域,而且也是血管性痴呆的重要受损部位,以往的研究表明,海马神经元凋亡在AD和VaD的发病中均起着重要的作用,但SB202190和SB203580对海马神经元凋亡因子表达和学习记忆能力的影响却少有报道,特别是SB202190和SB203580对海马神经元凋亡和Bcl-2、Caspase-3表达影响的研究国内外未见有报道。为了探讨海马神经元凋亡在AD和VaD中的致病机制以及对认知功能的影响,历时6年课题组做了以下3项课题:1.应用雌二醇对AD痴呆小鼠模型海马神经细胞元凋亡的保护作用机制和认知功能影响进行了研究,本研究利用切除双侧卵巢的小鼠,经侧脑室内注射Aβ1-42的方法建立阿尔茨海默病（AD）模型,并给予雌二醇（E2）治疗,研究Aβ1-42诱导的海马神经毒性及分子机制,评价E2拮抗Aβ1-42诱导的海马神经毒性的效果和分子机制。2.应用p38MAPK抑制剂对VaD痴呆大鼠模型海马神经细胞凋亡的保护作用机制和认知功能影响进行了研究,在这项研究中,我们研究了 SB203580、SB202190对血管性痴呆大鼠海马细胞凋亡和学习记忆能力的影响。观察了 p38 MAPK抑制剂对脑细胞凋亡的保护作用,并借助海马依赖性水迷宫试验检测了大鼠的空间参考学习和记忆能力。3.应用TPX2研究对阿尔茨海默病模型大鼠神经细胞凋亡的保护作用机制。借助海马依赖性水迷宫试验检测了大鼠的空间参考学习和记忆能力。TUNEL染色检测脑组织细胞凋亡,H E染色观察各组脑组织细胞,Western blot检测ERK和p38 MAPK的表达,采用RT-PCR方法检测MAPK、ERK和p21中mRNA的表达水平。观察了 TPX2对经β1-42处理脑组织的细胞凋亡有保护作用,进一步通过抑制MAPK、ERK和p38蛋白的表达而探讨了其作用机理。总之,课题组通过以上3项研究,旨在进一步阐明p38MAPK抑制剂和雌二醇对痴呆鼠模型海马神经元凋亡的保护作用机制以及对痴呆模型认知功能的影响。第一部分 雌二醇治疗对小鼠阿尔茨海默病模型海马神经元发生及认知功能障碍的早期保护作用目的:本研究利用切除双侧卵巢的小鼠,经侧脑室内注射Aβ1-442的方法建立阿尔茨海默病（AD）模型,并给予雌二醇（E2）治疗。检测Aβ1-42诱导的神经毒性及分子机制;评价E2拮抗Aβ1-42诱导的神经毒性的效果和分子机制。方法:1.双侧卵巢切除术:所有小鼠双侧卵巢切除并立即皮下植入药物,可以持续释放药物60天,内含有E2 0.18毫克。2.动物模型的制备:AD模型组小鼠Aβ1-42（4μg/mouse）,缓慢注射（0.5μl/min）;安慰剂组小鼠注射等量生理盐水（4μg/mouse）。3.BrdU注射:BrdU连续3次腹腔注射,间隔6小时,给药剂量为50mg/kg。4.雌二醇治疗:（1）早期E2治疗:注射BrdU后第7天双侧海马注射Aβ1-42,后给予7天雌二醇皮下注射,3 μg/day。（2）后期E2治疗:注射BrdU后第7天双侧海马注射Aβ1-42,7天后再给予7天雌二醇皮下注射,3 μ g/day。5.Morris水迷宫实验:计算每组小鼠平均游泳速度、延迟时间。在实验的第8天,撤去隐蔽的水面下平台,观察并记录小鼠的游泳速度及登台潜伏期。6.免疫染色:采用NeuN和BrdU免疫染色检测海马神经的生成。7.ELISA检测:检测促黄体生成激素（LH）、促卵泡激素（FSH）、雌激素（Estrogen）、孕酮（Progesterone）血清水平。8.RT-PCR:从大脑样本中取出海马组织,在冰上用剪刀将其剪碎。总mRNA采用Trizol试剂提取和RNA反转录与PrimeScriptTMRT试剂盒。9.Western blotting检测信号通路蛋白的表达:从大脑样本中取出海马组织,在冰上用剪刀将其剪碎。蛋白样品的提取采用放射免疫沉淀试验（RIPA）缓冲液。10.cAMP浓度测定:海马组织,在冰上用剪刀将其剪碎。组织颗粒在裂解缓冲液中裂解10分钟,在4℃、14000 rpm离心10分钟,收集上清液并用LANCETM cAMP 384试剂盒测定环磷酸腺苷（cAMP）浓度。11.透射电子显微镜:腹腔麻醉后小鼠,经心脏用2.5%戊二醛灌注并取出海马组织,海马组织继续用2.5%戊二醛固定过夜,在4℃,四氧化锇固定2小时后制作超薄切片（60 nm）,用丙酮脱水和醋酸铀染色。结果:1.小鼠海马注射Aβ1-42后,进行Morris水迷宫测试评,估认知功能,特别是空间学习和记忆能力（图1A）。在培训第1-2天,接受Aβ1-42注射的“老年”鼠在发现可见平台的游泳速度或时间延迟上与对照组相比没有差异,这表明空间学习能力不是在Aβ1-42注射后立即受到影响（P>0.05,n=10;见图1A）。相反,改为隐藏平台培训的第3-7天,Aβ1-42小鼠比对照组小鼠时间延迟更长,这些差异在5-7天显着,这表明记忆功能是在Aβ1-42注射后5天开始明显受损（P<0.01,n=10;见图 1A）。从迷宫中去掉平台后,观察小鼠在每个象限停留的时间比例（图1B）。Aβ1-42小鼠在象限虚拟平台的位置所花费的时间百分比明显减少。在本研究中,通过NeuN和BrdU染色标记海马神经元（图1C）,染色结果显示Aβ1-42模型组小鼠BrdU注射后21到28天,NeuN、BrdU 阳性细胞数量均显着减少（P<0.01,n=10;图1D）。这些结果表明,小鼠海马神经元在接受Aβ1-42注射后发生严重损害。2.为评估E2对AD小鼠病理过程中早期阶段的影响,在造模后立即给予E2治疗（图2C）。与单纯对照组相比,接受E2治疗的对照组海马神经元再生无明显变化,而Aβ1-42小鼠接受E2治疗与未接受E2治疗比较,NeuN和BrdU 阳性细胞显着增加（P<0.01,n=3;图2D）。此外,给予E2治疗后,AD小鼠找到隐藏平台的潜伏期显着降低（P<0.01,n=10;图2A）,在撤出平台的象限所停留的时间比例明显升高（P<0.01,n=10;图2B）。这些研究结果表明,在Aβ1-42小鼠AD病理过程的早期阶段,雌激素治疗增加海马元神经再生并促进认知功能的恢复。3.为评估E2对AD小鼠病理过程中后期阶段的影响,在造模后第7天开始给予E2治疗（图2C）。无论是对照组还是模型组,E2治疗均没有改善海马神经元再生,NeuN和BrdU阳性细胞没有明显变化（P>0.05,n=3;见图3D）。此外,给予E2治疗,并没有降低AD小鼠找到隐藏平台的潜伏期（P>0.05,n=10;见图3A）。在撤出平台的象限停留时间比例没有明显升高（P>0.05,n=10;见图3B）。4.通过测定LH、FSH、雌激素和孕激素的血清水平,确认E2的效果。在E2治疗前FSH,LH,雌激素或孕激素水平没有显着差异（P>0.05,n=6;图4A-D）,但在E2治疗后LH、FSH、雌激素水平显着增加,而孕酮水平明显下降（P<0.01,n=6;图 4A-D）。在早期给与雌二醇的Aβ1-42小鼠,TrkB、BDNF的mRNA及蛋白水平显着上调,而P75NTR表达水平减少（P<0.01,n=3;图4E,F）。这些结果表明,E2诱导的神经发生,至少部分通过BDNF/TrkB通路。对这一途径的下游因子进行了检测（图4E,F）和结果与以前的研究结果相一致,STAT3/CREB/ERK信号通路的激活明显增加（P<0.01,n=3;图4E,F）。本研究还对cAMP水平进行评估,以确认BDNF/TrkB下游信号通路的活化（图4D）。5.与后期E2治疗及未给予E2治疗比较,在早期给与雌二醇的A β 1-42小鼠,NO和ROS的水平明显降低（P<0.01,n=3;图5A）。相应的细胞死亡相关的Cytochrome-c/Bax/Bcl-2/acspase-3 信号通路因子活化下调（P<0.01,n=3;图5B-C）。这些结果表明,E2降低AD病理过程早期阶段海马区的细胞的氧化应激及死亡通路相关因子的活化,促进认知功能的恢复。6.与后期E2治疗及未给予E2治疗比较,在早期给与雌二醇的Aβ1-42小鼠,胶质细胞增生显着降低（P<0.01,n=3:图6A,B）。E2介导的炎症反应,上调抗炎信号通路的因子活化（CD206,FIZZ1,1、TGFβ）并下调促炎信号通路因子的活化（IL-1β,TNF 和 IL-6。P<0.01,n=3;图 6C-E）。7.在本研究中,使用透射电镜观察海马突触的超微结构。与后期E2治疗及未给与E2治疗比较,发现在早期给与雌二醇的Aβ1-42小鼠,突触的数量显着增加（P<0.01,n=3;图7A）。为了进一步探讨E2对不同类型突触的作用,采用Western blot对海马NMDA受体和AMPAR受体水平进行分析。NMDA受体（GluN1和GluN2）水平没有明显影响,而AMPAR受体水平（GluA1 GluA2）明显增加（P<0.01,n=3;图7B,C）。此外,还有重要的突触后蛋白Hevin和SPARC表达明显增加（P<0.01,n=3;图7B,C）,这两种蛋白在突触的生成及功能方面起着重要作用。结论:1.Aβ1-42小鼠认知功能减退与海马区神经元发生有关。小鼠海马神经元在接受Aβ1-42注射后发生严重损害,海马神经元损害在认知功能障碍方面起到重要作用。2.AD早期阶段E2可增加海马神经元再生并促进认知功能的恢复,而后期阶段E2治疗对的海马神经元再生及认知功能无改善。3.AD早期阶段E2治疗上调Aβ1-42小鼠海马神经元再生相关信号通路。4.AD早期阶段E2治疗可减少氧化应激、下调细胞死亡相关的信号通路活性。5.AD早期阶段E2治疗抑制Aβ1-42小鼠海马小胶质细胞过度增生。6.AD早期阶段E2治疗可增加海马神经元突触受体数量。第二部分 P38MAPK抑制剂对血管性痴呆大鼠海马细胞凋亡的保护作用及学习记忆能力的影响目的:本研究利用应用双侧颈总动脉结扎法（2-VO法）制作血管性痴呆（VaD）大鼠模型,经侧脑室内注射SB202190和SB203580的方法对VaD大鼠学习记忆能力进行研究,观察p38MAPK抑制剂对VaD大鼠海马依赖的Morris水迷宫的认知功能所起的作用,并通过研究海马神经元凋亡、海马区P38MAPK磷酸化变化及Bcl-2和Caspase-3表达,研究SB202190和SB203580对血管性痴呆大鼠海马区的神经保护机制,探讨海马神经元凋亡在血管性痴呆的发病机制中所起的作用。方法:利用应用双侧颈总动脉结扎法（2-VO法）制作血管性痴呆（VaD）大鼠模型,随机分为SB202190治疗组、SB203580治疗组、对照组和假手术组。假手术组只分离出双侧颈总动脉并不对其结扎,作为两血管法VaD模型的正常对比。治疗组采用侧脑室注射给药方式分别给予P38MAPK抑制剂SB202190、SB203580,对照组和假手术组采用侧脑室注射给药方式给予等量二甲基亚矾（DMSO）,注射药物2周后用Morris水迷宫法测试各组大鼠的学习记忆能力的变化。注射药物后应用TUNEL法检测海马区神经元凋亡,应用蛋白印迹（Western blot）法检测大鼠海马区P38MAPK磷酸化变化,免疫荧光法和激光共聚焦显微镜观察大鼠海马区Bcl-2和Caspase-3表达,以探讨SB202190和SB203580对血管性痴呆大鼠海马区的神经保护机制。结果:1.本研究对平台逃避潜伏期、空间学习、大鼠的SB203580或SB202190治疗效果均进行了研究。结果表明,SB203580和SB202190治疗组平台逃避潜伏期与假手术组和对照组相比明显缩短（**P<0.01）,说明大鼠的空间学习能力得以提高。2.给予SB203580和SB202190治疗5天后我们还观察到海马磷酸化激活P38 MAPK表达水平在各治疗组间差异显着（**P<0.01,SB203580治疗组或SB202190组治疗VS假手术组和对照组）。结果显示,SB203580或SB202190治疗后p38MAPK的表达显着降低。SB203580和SB202190治疗组间无显着差异。3.SB203580和SB202190有助于海马神经元抵抗慢性缺血诱导的细胞凋亡。为了探索SB203580和SB202190是否对血管性痴呆大鼠体外海马细胞凋亡和学习记忆能力有效,本实验用HT22细胞测试SB203580和SB202190的治疗效果。与对照组相比,用SB203580或SB202190治疗后实验组海马神经元凋亡减少。实验也证实了在体内SB203580、SB202190对海马细胞凋亡和血管性痴呆大鼠学习记忆能力是有疗效的。侧脑室注射SB203580和SB202190治疗五天后,处死大鼠,与对照组、SB203580和SB202190组相比,假手术组TUNEL阳性细胞数（脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导缺口末端标记,绿色荧光）显着下降（**P<0.01）。然而,SB203580和SB202190组与对照组相比,前者TUNEL阳性细胞数目显着降低;而且SB203580组与SB202190组相比,前者TUNEL 阳性细胞较少。总之,SB203580和SB202190有助于海马神经元抵抗慢性缺血诱导的细胞凋亡。4.本实验研究了 SB203580和SB202190对VaD大鼠海马区施加的抗凋亡能力。脑室注射五天后,处死大鼠获取VaD大鼠海马标本。SB203580或SB202190培养48小时后,进行实验计算实验组凋亡细胞的数量（n=3）。P38MAKA培养后,HT22细胞出现皱缩,碎裂成膜结合凋亡小体,很快被邻近细胞吞噬。P38MAKA能够减少HT22细胞的凋亡。而SB203580或SB202190治疗组凋亡的HT22细胞数量均显着低于对照组。5.在VaD大鼠模型的海马标本上进行了 P38 MAKA和凋亡相关基因之间的关系研究。我们对P38MAKA诱导细胞凋亡相关的mRNA的表达水平进行了分析。与假手术组和对照组相比,细胞凋亡抑制基因BAX和Bcl-2在VaD大鼠海马经SB203580 或 SB202190 治疗后表达增加。caspase-8、caspase-3 和 caspase-9 的表达在SB202190或SB203580治疗组比对照组均显着降低。但SB202190治疗组细胞凋亡抑制基因Bax和Bcl-2的表达比SB203580组略高,这表明SB202190可通过抑制P38 MAKA的活性而减少细胞凋亡,依赖线粒体的凋亡途径可以由慢性缺血激活。6.大鼠经SB203580和SB202190治疗存活时间延长 实验组其余VaD大鼠模型继续存活以观察治疗的远期疗效。假手术组和对照组大鼠在第30天处死。相反,约30%SB202190组和60%SB203580组的动物最后需要处死（**P<0.01）。这说明与SB203580相比,SB202190治疗可进一步延长大鼠的存活时间。其中,相对于SB203580,SB202190较好的治疗效果体现在VaD大鼠显着的生存优势（**P<0.05）结论1.P38MAPK抑制剂SB202190和SB203580,能提高或改善VaD大鼠的学习记忆能力。2.本研究给予VaD大鼠P38MAPK抑制剂治疗后p38MAPK的表达显着降低,有效减少海马神经元细胞凋亡,促进记忆障碍重建,且耐受性良好。3.SB203580和SB202190通过抑制P38 MAKA的活性而减少细胞凋亡,有助于海马神经元抵抗慢性缺血诱导的细胞凋亡,依赖线粒体的凋亡途径可以由慢性缺血激活。4.大鼠经SB203580和SB202190治疗存活时间延长,与SB203580相比,SB202190治疗可进一步延长大鼠的存活时间。第三部分 TPX2对阿尔茨海默病模型大鼠神经细胞凋亡的保护作用机制的研究目的:研究TPX2对阿尔茨海默病模型大鼠神经细胞凋亡的保护作用机制。方法:将90只大鼠随机分为药物组、对照组和空白组,每组30只。在药物治疗组和空白组大鼠用1 0%水合氯醛麻醉（0.5ml/100g剂量）,在大鼠双侧海马区域的准确位置注入Aβ1-425ul（浓度1μg/ul）建立模型。将配置的TPX2抑制剂制成溶液。模型建立后,各组大鼠分别给予不同的治疗方法;药物组大鼠将TPX2-siRNA溶液连接10μl微量注射器给予侧脑室注射10μl,对照组大鼠给予侧脑室注射等量1%DMSO溶液。空白组为正常健康组,本组大鼠未作任何手术或药物治疗。大鼠脑组织分为两个部分,一部分是固定、脱水、石蜡包埋、制成约5um厚度的切片。TUNEL染色检测脑组织细胞凋亡,HE染色观察各组脑组织细胞,Western blot检测ERK、MAPK和p38的表达水平,采用RT-PCR方法检测MAPK、ERK和p38中mRNA的表达水平。结果:一周后,TUNEL染色显示在药物组脑组织细胞凋亡率明显高于对照组和空白组,差异具有统计学意义（P<0.05）;使用TPX2抑制剂后,药物组TPX2的mRNA表达水平显着低于对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）,分别检测MAPK和p38蛋白的mRNA表达水平,药物组MAPK水平显着高于对照组及空白组,差异具有统计学意义（P<0.05）;Western blot灰度值比较中发现,MAPK和p38的表达水平无显着差异,其差异不具有统计学意义（P>0.05）。然而,在药物组中,MAPK、p38表达水平明显高于对照组,空白组MAPK灰度值则明显下降,其差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:因此,TPX2通过抑制MAPK、ERK和p38蛋白的表达抑制经Aβ1-42处理的脑组织细胞发生凋亡,对其有保护作用。
周哲屹[9]（2019）在《瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠神经保护作用和机制研究》文中指出目的:本实验主要分为三个部分,第一个实验主要探讨瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠神经保护的作用,观察MCAO术后,在6h、24h、72h、7d、14d较长时间段神经功能缺损的情况及瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠脑梗塞体积及脑组织细胞形态学的影响,同时与经典的艾灸治疗,以及NK-κ B抑制剂NAC及NAC联合神火灸做对比;第二部分观察瑶医神火灸对氧化应激、炎症、细胞凋亡相关指标的影响;第三部分探讨瑶医神火灸是否通过介导NF-κ B炎症通路起神经保护作用及相关机制研究。方法:对于整体的动物实验方案:（1）使用线栓法进行阻塞大脑中动脉（MCAO法）建立实验大鼠缺血再灌注损伤动物模型,缺血2h,再灌注24h,观察大鼠行为学,使用Zea-longa评分法观察大鼠神经功能缺损评分情况,评价造模是否成功。将实验大鼠采用随机数字法分为六组:假手术组、模型组、神火灸治疗组、艾灸治疗组、NAC组、神火灸+NAC组;治疗组采用神火灸、艾灸治疗,NAC采用脑室注入方法干预,（1）观察不同时段（6h、24h、72h、7d、14d）神经功能评分;（2）TTC法检测脑梗塞体积;（3）HE染色观察脑组织切片的形态学变化;（4）尼氏染色观察神经元损伤情况;（5）氧化应激相关生化指标的检测:于14d采集大鼠外周血,取血分离血清,ELISA法观察血清中MDA、SOD活性情况;（6）于14d采集大鼠外周血,取血分离血清,ELISA法观察血清炎症因子TNF-α、IL-1、IL-10的表达情况;（7）观察各组TUNNEL细胞凋亡情况;（8）采用免疫组化法、Western Blotting法、qPCR法测各组NF-κ B通路相关蛋白（Cox-2、iNOS、NF-κ B/p65、Bax、Bcl-2、Caspase-3）,确定瑶医神火灸治疗对相关通路蛋白和下游凋亡因子的影响。结果:1、瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠神经功能缺损的影响Sham（假手术组）大鼠行为、肢体功能无异常表现,评分:0分。而模型组出现向对侧转圈或者倾倒等神经功能缺失,和假手术组比较模型组神经功能缺损评分具有显着性差异。各治疗组在缺血再灌注6h、24h、72h时神经功能缺损评分无显着性差异（P>0.05）,在I/R后72h时,神火灸治疗组和艾灸治疗组与模型组相比,神经功能缺损并未出现显着改善（P>0.05）,而在治疗7d时,神火灸治疗组神经功能缺损较模型组有降低（P<0.05）,效果持续至14天更明显（P<0.01）。艾灸组与模型组比较对神经功能缺损的影响并不明显（P>0.05）。而NAC组作为一种抗氧化剂,在使用7d、14d明显起效,显着改善I/R大鼠神经功能缺陷,与模型组比较具有显着性差异（P<0.01）,与神火灸组疗效相当（P>0.05）;和模型组比较,NAC+神火灸在7d、14d出现神经功能缺损评分降低（P<0.01）。14d时,神火灸+NAC联用神经功能缺损评分数值下降,但和单用神火灸比较差异并不显着。2、瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠脑损伤体积的影响通过图像分析软件分析及计算,与假手术组比较,TTC染色后MCAO术后大鼠冠状脑组织切片可见明显脑梗塞病灶（P<0.01）,在治疗开始的24h时,梗塞体积未见明显差异,说明各治疗组在24h内均未对I/R大鼠脑梗死体积产生影响;14d时,艾灸组脑梗死体积与模型组比较具有统计学差异（P<0.05）;神火灸组、NAC组和NAC+神火灸治疗组与模型组比较,大鼠梗死体积下降明显,统计具有显着差异（P<0.01）,说明神火灸对脑梗死体积的神经保护作用较明显,NAC也具有神经保护的作用,其保护作用神火灸和NAC 比较对脑梗塞体积的影响未见明显差异,神火灸和NAC联用梗死体积数值下降,但和单用神火灸比较差异并不显着（P>0.05）。3、神火灸对动物大鼠的缺血再灌注损伤缺血脑组织相关病理学影响HE染色结果提示,假手术组（sham）大鼠脑组织细胞形态学基本正常,而模型组大鼠出现缺血中心神经细胞坏死,组织结构排列紊乱,细胞间隙增宽,细胞肿胀,核固缩,结构严重破坏;而神火灸治疗可改善神经元细胞死亡率,减轻缺血再灌注损伤,相对于模型组,其神经细胞异常相对较轻,核膜完整、染色质均匀一致、细胞器破坏较少;艾灸组其形态学改变和神火灸组基本一致;而NAC和NAC+神火灸治疗组大鼠缺血脑组织于镜下可见神经肿胀较轻,较模型组坏死细胞的数量显着减少,说明NAC作为抗氧化剂保护作用明确,和神火灸联用时炎症细胞浸润减少,细胞坏死、核固缩情况明显减轻。4、Nissl染色法观察缺血脑组织神经元数目Nissl染色结果显示,与模型组相比,神火灸和艾灸治疗组Nissl小体的数量增多,细胞形态较为正常,结构较为完整,提示灸治疗可减少I/R后神经元的损伤;而NAC组和NAC+神火灸治疗组Nissl小体的数量更多,大部分细胞形态正常,结构完整,说明NAC和NAC+神火灸治疗明显促进了脑缺血组织神经元存活。5、瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠MDA、SOD表达情况的影响本实验显示,脑缺血再灌注造模后,与假手术组比,模型组MDA水平明显上升（P<0.01）,SOD活化明显降低（P<0.01）,表明氧化应激损伤明显,SOD活性受到明显抑制,抗氧化能力减低。使用艾灸干预时,MDA水平下降,与模型组相比具有统计学差异（P<0.05）,SOD活性上升（P<0.05）;神火灸干预后,MDA水平明显下降（P<0.01）,SOD活性明显上升（P<0.01）,说明神火灸治疗能够显着提高SOD的活化能力,增强I/R损伤大鼠脑组织抗氧化应激的能力,减轻氧化应激相关损伤,并通过抗脂质过氧化相关反应对I/R损伤起保护作用。而在给予NAC侧脑室注射及NAC联合神火灸治疗时,缺血再灌注大鼠脑组织的SOD活力明显升高（P<0.01）,MDA含量明显降低（P<0.01）,其抗氧化效果优于单用神火灸（P<0.05）,提示NAC可调节缺血再灌注损伤引起的机体氧自由基释放、氧化还原应激失衡状态,减轻机体的氧化应激损伤,在与瑶医神火灸联合使用时,对SOD活性的激活和降低MDA含量方面明显优于单独使用神火灸（P<0.01）。6、瑶医神火灸对炎症因子表达情况的影响（TNF-α、IL-1、IL-10）研究结果显示,14d时,与Sham组比较,模型组TNF-α、IL-1 β、IL-10水平显着上升（P<0.01）;与模型组比较,神火灸组和艾灸治疗组干预后TNF-α、IL-10、IL-1 β水平下降具有显着性差异（P<0.01）;NAC组和NAC+神火灸治疗组TNF-α、IL-1 β、IL-10水平与神火灸治疗组具有相同变化趋势,与模型组比较水平下降明显（P<0.01）。而与神火灸组比较,NAC+神火灸联用TNF-α、IL-1 β水平明显下降（P<0.01）,IL-10也有所下降（P<0.05）,说明NAC和神火灸联用对炎症因子的降低作用更明显。7、瑶医神火灸对细胞凋亡的影响本实验显示,脑缺血再灌注造模后,与假手术组相比,模型组Tunel阳性细胞明显增加,表明细胞凋亡显着增加。使用艾灸和神火灸干预后,Tunel阳性细胞明显减少,与模型组相比,具有明显统计学差异（P<0.01）,说明神火灸治疗能够一定程度上减少缺血脑组织细胞的凋亡,对I/R损伤起保护作用。而在给予NAC侧脑室注射及NAC联合神火灸治疗时,缺血再灌注大鼠脑组织的细胞凋亡较模型组明显降低（P<0.01）,提示NAC可明显减轻缺血脑组织细胞凋亡。与神火灸组比较,NAC及NAC联合神火灸使用对细胞凋亡率的影响差异不显着（P>0.05）。8、瑶医神火灸对NF-κ B通路相关蛋白及下游凋亡因子的影响（Cox-2、iNOS、NF-κ B/p65、Bax、Bcl-2、Caspase-3）8.1脑组织中Cox-2、iNOS表达情况（免疫组化、WB检测、qPCR检测）研究结果提示,在缺血再灌注损伤后,和Sham组相比,免疫组化法显示模型组大鼠脑组织中Cox-2、iNOS阳性表达细胞增加（P<0.01）,脑组织中Cox-2和iNOS蛋白含量增加（P<0.01）,Cox-2 mRNA 和 iNOS mRNA 含量升高（P<0.01）,提示 Cox-2、iNOS参与了缺血再灌注损伤的过程;与模型组相比,艾灸组Cox-2免疫组化阳性细胞表达、Cox-2蛋白表达显着减少（P<0.01）,Cox-2mRNA含量减少（P<0.05）,iNOS 阳性细胞表达减少（P<0.05）,iNOS蛋白表达、iNOSmRNA含量显着减少（P<0.01）。与模型组比较,神火灸治疗可以明显降低Cox-2、iNOS阳性细胞表达,降低脑内Cox-2、iNOS蛋白的表达和脑内Cox-2、iNOSmRNA含量,结果具有显着统计学差异（P<0.01）,提示神火灸和艾灸一样,具有抑制Cox-2和iNOS保护脑组织的作用,并且与神火灸组相比,艾灸对iNOS 阳性细胞的表达明显升高（P<0.01）,iNOS蛋白表达增加（P<0.05）,提示神火灸抑制iNOS表达的作用优于艾灸组。而对于NAC组和NAC+瑶医神火灸治疗组,Cox-2、iNOS 阳性表达细胞减少,脑组织中Cox-2和iNOS蛋白含量减少,Cox-2 mRNA和iNOS mRNA含量减少较模型组更明显（P<0.01）,说明NF-κ B的抑制剂NAC可以明显减少Cox-2、iNOS的阳性表达,逆转脑组织缺血后的损伤,促进神经功能修复。与神火灸组比较,NAC+神火灸联用对Cox-2阳性细胞的表达、Cox-2、iNOS蛋白含量和Cox-2、iNOS mRNA的表达水平下降更为明显（P<0.01）,提示联合应用对Cox-2、iNOS的影响明显优于单独使用神火灸。8.2脑组织中NF-κ B/p65表达情况（免疫组化、WB检测、qPCR检测）本研究结果提示,在脑缺血再灌注14d后,免疫组化结果显示,与Sham组比较,模型组缺血脑组织NF-κ B p65阳性表达增多（P<0.01）,说明NF-κ B p65被激活,同时NF-κ B p65移位到胞核内的阳性细胞数增多,同时WB提示NF-κ B p65蛋白的表达增加（P<0.01）,qPCR 提示 NF-κ B p65 mRNA 上调（P<0.01）,说明 NF-κ B p65通路被激活。与模型组比较可以看出,艾灸治疗可以减少缺血脑组织NF-κ B/p65阳性细胞表达（P<0.05）、降低脑内NF-κ B/p65蛋白表达（P<0.05）,显着减少脑内NF-κB/p65mRNA表达（P<0.01）,而神火灸减少NF-κ B/p65阳性细胞表达、蛋白表达及脑内NF-κ B/p65mRNA表达更明显（P<0.01）,提示神火灸和艾灸治疗可能是通过抑制缺血脑组织NF-κ B/p65表达起到减轻MACO大鼠I/R脑损伤作用。而在降低脑内NF-κ B/p65蛋白表达方面,神火灸组优于艾灸组（P<0.05）。而NAC和NAC+神火灸可以显着减少NF-κ B/p65阳性细胞表达、蛋白表达及脑内NF-κ B/p65mRNA表达（P<0.01）,效果显着,并且NAC和神火灸联用对NF-κ B/p65的作用显着优于单一的神火灸治疗（P<0.01）。8.3脑组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3表达情况（免疫组化、WB检测、qPCR检测）本实验通过对I/R大鼠的免疫组化、Western blot及qPCR检测发现,与Sham组相比MCAO组Bax、caspase-3明显升高（P<0.01）,Bcl-2水平明显降低（P<0.01）。与模型组比较,艾灸治疗组Bax阳性细胞表达明显减少（PP<0.01）,Bcl-2阳性细胞增加、caspase-3 阳性细胞表达减少无统计学意义（P>0.05）,脑内Bax、caspase-3蛋白表达下降（P<0.01）,脑内Bax mRNA表达减少（P<0.05）、Caspase-3 mRNA表达显着减低（P<0.01）;脑内Bcl-2蛋白增加无显着意义（P>0.05）,Bcl-2 mRNA水平增加（P<0.05）;说明艾灸对于Bax、caspase-3、Bcl-2的调节具有一定作用,但是作用不稳定,各种检测结果存在差异。而与模型组相比,神火灸组Bax、caspase-3阳性细胞表达减少（P<0.01）,Bcl-2阳性细胞表达升高（P<0.05）;Bax、caspase-3蛋白表达下降（P<0.01）,Bcl-2 蛋白表达上升（P<0.01）,脑内 Bax mRNA、caspase-3 mRNA表达下降明显（P<0.01）,及脑内Bcl-2mRNA表达上升（P<0.01）,说明神火灸治疗可以通过影响细胞内Bcl-2、Bax、caspase-3等相关凋亡因子的水平从而影响细胞凋亡,并且和艾灸组比较,神火灸对降低Bax、Caspase-3蛋白表达的作用优于艾灸（P<0.01）。对于NAC组及神火灸+NAC组,caspase-3、Bax阳性细胞表达、脑内蛋白水平和mRNA水平下降更为明显（P<0.01）,Bcl-2阳性细胞表达、脑内蛋白水平和mRNA水平明显上升（P<0.01）,提示NAC具有影响相关凋亡因子抗凋亡的作用,联合神火灸使用对于细胞凋亡途径的影响作用更强,和神火灸单一治疗比较差异具有显着统计学意义（P<0.01）,联合治疗可以起到较强抗凋亡的神经保护作用。结论:1.神火灸改善了脑缺血再灌注大鼠神经功能缺损情况,减轻了缺血脑组织形态和病理学改变,对缺血再灌注大鼠具有神经保护的作用。2.瑶医神火灸对脑缺血再灌注大鼠损伤的神经保护作用与抗炎、抗氧化、抗凋亡的机制可能相关;3.瑶医神火灸对神经保护的作用机制可能是通过抑制NF-κ B炎症通路发挥抗炎、抗凋亡的作用。
杨迪[10]（2019）在《高糖环境下17β-雌二醇抑制大鼠髓核细胞凋亡和促进胞外基质合成的作用及初步机制探讨》文中研究表明椎间盘退变（intervertebral disc degeneration,IVDD）性疾病在临床上发病率高,是导致成人劳动力受限的主要原因,给社会造成巨大的经济负担。糖尿病（diabetes mellitus,DM）患者与非DM患者相比IVDD患病率显着升高,椎间盘内的高糖环境通过氧化应激（oxidative stress,OS）损伤引起髓核细胞（nucleus pulposus cells,NPCs）数目减少、细胞外基质（extracellular matrix,ECM）合成降解代谢紊乱是引起IVDD的因素之一。近年研究发现雌激素不但可以刺激胰岛素分泌改善胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）而且部分抑制NPCs凋亡,但是迄今尚未见关于17β-雌二醇（17β-estradiol,17β-E2）与高糖诱导NPCs凋亡相关方面的报道,因此,本实验首先通过胰酶联合Ⅱ型胶原酶体外分离培养并鉴定大鼠原代NPCs;再者探讨17β-E2对高糖环境下大鼠NPCs凋亡及ECM合成代谢的影响并揭示其可能的机制,另外明确雌激素受体β（estrogen receptor β,ERβ）在其中的介导作用。第一部分 原代大鼠髓核细胞的体外分离培养及鉴定目的:原代大鼠NPCs体外分离培养及鉴定。方法:通过胰酶联合Ⅱ型胶原酶体外分离大鼠原代NPCs并传代;通过聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增产物电泳检测NPCs标志物基因碳酸酐酶12（carbonic anhydrase 12,CA12）、叉头框F1（forkhead box F1,FOXF1）、多效生长因子（pleiotrophin,PTN）,免疫细胞化学染色聚集蛋白聚糖（aggrecan,AGG）和Ⅱ型胶原（collagen Ⅱ,Col Ⅱ）及性别决定区Y高迁移率族蛋白盒9（Sry-type HMG box 9,SOX9）来鉴定大鼠原代NPCs。结果:成功分离培养、鉴定原代大鼠NPCs并传代。结论:通过细胞形态学、新型标志物基因、胞外基质标志蛋白及SOX9成功鉴定了NPCs。第二部分17β-雌二醇对高糖环境下的大鼠髓核细胞凋亡及胞外基质合成的影响目的:离体试验中探讨17β-E2对高糖环境下大鼠NPCs凋亡及ECM合成代谢的影响,并探讨ERβ在其中的介导作用。方法:原代NPCs传代,取第2代NPCs随机分为四组:高糖组（HG组,培养基中含有0.2 M葡萄糖）、高糖+17E2组（HG+17E2组,培养基中含有0.2 M葡萄糖+10-7M 17β-E2）、高糖+17E2+ERB041 组（HG+17E2+ERB041 组,培养基中含有0.2 M 葡萄糖+10-7M 17β-E2+10 的 ERB041）、高糖+17E2+PHTPP 组（HG+17E2+PHTPP组,培养基中含有0.2 M葡萄糖+10-7M 17β-E2+1μM的PHTPP）;干预72小时后,采用1)Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡;2)实时荧光定量PCR（real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）检测凋亡相关因子（Bcl-2、Bax、Caspase-3）的基因表达;3)Western blot 检测凋亡相关蛋白（Cleaved caspase-3、Cleaved PARP）细胞中的表达;4)RT-PCR检测ECM Col Ⅱ和AGG基因表达;5)免疫细胞化学染色检测ECM Col Ⅱ及AGG的蛋白表达。结果:高糖状态下大鼠NPCs凋亡率增加,ECM Col Ⅱ及AGG合成代谢减少;17β-E2干预后可以减少高糖状态下的大鼠NPCs的凋亡率,下调促凋亡因子（Bax、Caspase-3）基因表达,上调抗凋亡因子（Bcl-2）基因表达,降低凋亡相关蛋白（Cleaved caspase-3、Cleaved PARP）在细胞中的表达;增加ECM Col Ⅱ及AGG基因表达及蛋白表达;联合使用ER β受体激动剂ERB041及17β-E2较单用17β-E2进一步减少了高糖状态下NPCs凋亡率,下调促凋亡因子（Bax、Caspase-3）基因表达,上调抗凋亡因子（Bcl-2）基因表达,降低凋亡相关蛋白（Cleaved caspase-3、Cleaved PARP）在细胞中的表达;进一步增加了 ECM Col Ⅱ及AGG的合成代谢,联合使用ERβ受体抑制剂PHTPP及17β-E2较单用17β-E2增加了高糖状态下NPCs凋亡率,上调了促凋亡因子（Bax、Caspase-3）基因表达,下调了抗凋亡因子（Bcl-2）基因表达,增加了凋亡相关蛋白（Cleaved caspase-3、Cleaved PARP）在细胞中的表达;减弱了 ECM Col Ⅱ及AGG的合成代谢。结论:高糖状态下大鼠NPCs凋亡增加,ECM Col Ⅱ及AGG合成代谢减弱;17β-E2可通过ER β介导降低高糖状态下的大鼠NPCs的凋亡率,增加ECM Col Ⅱ及AGG的合成代谢。第三部分17β-雌二醇通过雌激素受体β介导抑制高糖状态下大鼠髓核细胞内氧化应激损伤目的:观察17β-E2对高糖环境下大鼠NPCs内活性氧（reactive oxygen species,ROS）的影响,并明确其与ER β的相关性。方法:取第2代NPCs随机分为四组:高糖组（HG组,培养基中含有0.2 M葡萄糖）、高糖+17E2组（HG+17E2组,培养基中含有0.2 M葡萄糖+10-7M 17β-E2）、高糖+17E2+ERB041组（HG+17E2+ERB041组,培养基中含有0.2 M葡萄糖+10-7 M 17β-E2+10 μM 的 ERB041）、高糖+17E2+PHTPP 组（HG+17E2+PHTPP 组,培养基中含有0.2 M葡萄糖+10-7M 17β-E2+1 μM的PHTPP）;干预72小时后,采用DCFH-DA法检测各组细胞内ROS水平。结果:各组细胞内ROS检测结果提示:HG+17E2组细胞内ROS水平低于HG组（P<0.05）,HG+17E2+ERB041 组细胞内 ROS 水平低于 HG+17E2 组（P<0.05）,HG+17E2+PHTPP 组细胞内 ROS 水平高于 HG+17E2组（P<0.05）。结论:17β-E2可降低高糖状态下大鼠NPCs内ROS水平,ER β介导这一过程发生。
二、17-β雌二醇对大鼠脑缺血再灌注后Bcl-2表达的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、17-β雌二醇对大鼠脑缺血再灌注后Bcl-2表达的影响（论文提纲范文）
（1）荭草苷对脑缺血再灌注大鼠脑组织线粒体自噬的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 第一部分 荭草苷和牡荆苷对脑缺血再灌注大鼠神经保护作用比较 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 第二部分 荭草苷对脑缺血再灌注大鼠脑组织线粒体功能和线粒体自噬作用的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 第三部分 荭草苷对脑缺血再灌注大鼠脑组织PI3K/Akt通路的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 线粒体自噬在脑缺血再灌注损伤中作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）基于PI3K/AKT信号通路探讨鹿茸多肽改善轻度认知功能障碍的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 第一章 VAP鉴定及检测 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 基于网路药理学探讨鹿茸改善MCI的作用机制 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 基于PI3K/AKT信号通路探讨VAP改善不同MCI模型大鼠认知功能障碍的作用机制 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计学分析 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第四章 基于代谢组学分析VAP改善MCI模型大鼠认知功能障碍的作用机制 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 数据处理 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第五章 基于PI3K/AKT信号通路探讨VAP拮抗由OA诱导的受损HT22细胞的作用机制 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计学分析 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 结论 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简介 |
（3）雌激素对血管性痴呆大鼠认知功能及凋亡自噬相关蛋白和Wnt/β-catenin信号通路的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 去卵巢血管性痴呆大鼠模型的建立及雌激素对去卵巢血管性痴呆大鼠认知功能的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 雌激素对血管性痴呆大鼠海马组织形态学的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 雌激素对血管性痴呆大鼠海马神经元细胞凋亡和自噬相关蛋白表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 雌激素对血管性痴呆大鼠海马组织Wnt/β-catenin信号通路的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第五部分 雌激素替代治疗对手术绝经患者术后认知功能的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 雌激素对女性认知功能的影响 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）针刺调控神经细胞自噬与凋亡以延长脑梗死溶栓时间窗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1. 中医学对脑梗死的认识 |
| 1.1 病名 |
| 1.2 病因病机 |
| 1.3 治则及针灸治疗 |
| 2. 现代医学对脑梗死的认识 |
| 2.1 流行病学 |
| 2.2 危险因素及发病机制 |
| 2.3 治疗 |
| 3. “针刺适度激活自噬并抑制凋亡可延长脑梗死溶栓时间窗”科学假说的理论依据 |
| 3.1 缺血半暗带是溶栓治疗的理论基础 |
| 3.2 延长安全时间窗是保证溶栓疗效的关键 |
| 3.3 挽救IP区神经细胞死亡是延长脑梗死溶栓时间窗的核心环节 |
| 3.4 自噬凋亡共同影响IP区神经细胞死亡进程 |
| 3.5 针刺介入延长脑梗死溶栓时间窗的可行性 |
| 3.6 “针刺适度激活自噬并抑制凋亡可延长脑梗死溶栓时间窗”科学假说的提出 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 针刺延长脑梗死溶栓时间窗的效应研究 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验耗材与设备 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 大鼠自体血栓栓塞模型制备及激光多普勒血流仪监测脑血流量 |
| 2.3 干预治疗方法 |
| 2.4 神经行为学评分 |
| 2.5 脑梗死体积测定 |
| 2.6 脑含水量测定 |
| 2.7 脑出血性转化测定 |
| 2.8 统计学处理 |
| 3. 实验结果与分析 |
| 3.1 造模过程中的脑血流量变化 |
| 3.2 神经行为学评分比较 |
| 3.3 脑梗死体积的比较 |
| 3.4 脑出血性转化比较 |
| 3.5 脑含水量比较 |
| 实验二 针刺调控神经细胞自噬与凋亡以延长溶栓时间窗的机制研究 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验耗材与设备 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 分组与模型制备 |
| 2.2 干预方法 |
| 2.3 样本采集 |
| 2.4 Western Blot |
| 2.5 RT-PCR |
| 2.6 统计学处理 |
| 3. 结果分析 |
| 3.1 各组大鼠神经细胞自噬相关指标（Beclinl、LC3II/1、p62)的表达比较 |
| 3.2 各组大鼠神经细胞凋亡相关指标（Bcl2、Bax)的表达比较 |
| 3.3 各组大鼠自噬凋亡复合物Bcl2/Beclin1和Bcl2/Bax蛋白表达比值的比较 |
| 第三部分 讨论 |
| 1. 实验设计 |
| 1.1 动物模型的制备 |
| 1.2 针刺方法的选择 |
| 1.3 溶栓药物的选择 |
| 1.4 干预时间点的选择 |
| 1.5 自噬凋亡相关指标的选择 |
| 2. 实验结果的讨论 |
| 2.1 针刺延长脑梗死溶栓时间窗的效应 |
| 2.2 针刺对自噬凋亡复合物的调控作用 |
| 第四部分 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）PI3K/Akt通道在七氟烷后处理脑缺血糖尿病大鼠神经保护作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表文章 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| English Paper One |
| English Paper Two |
（6）全脑缺血再灌注损伤后神经保护新策略及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩写对照表 |
| 第一部分:b FGF对大鼠全脑缺血再灌注后起神经保护作用及其机制研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第二部分:ANGIOPEP-2 修饰的聚乙二醇化2ME2 胶束对心跳骤停-心肺复苏后大鼠脑神经元起保护作用的研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第三部分:ROS在心跳骤停-心肺复苏后大鼠脑神经元自噬流受损中的相关机制研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间已发表或录用的论文 |
（7）PHLDA1在H2O2诱导的H9c2心肌细胞损伤和心肌缺血再灌注损伤中的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 实验动物和饲料 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞传代与培养 |
| 2.2.2 细胞转染 |
| 2.2.3 细胞计数 |
| 2.2.4 细胞分组 |
| 2.2.5 CCK8测定H9c2心肌细胞存活率 |
| 2.2.6 流式测定H9c2心肌细胞凋亡率 |
| 2.2.7 JC-1测定H9c2心肌细胞线粒体膜电位 |
| 2.2.8 ROS测定细胞内ROS |
| 2.2.9 RT-q PCR测定小干扰RNA敲减效率 |
| 2.2.10 大鼠尾静脉注射及离体心脏造模 |
| 2.2.11 TTC染色测定心肌梗死面积 |
| 2.2.12 HE染色测定心肌组织形态 |
| 2.2.13 Tunel测定心肌组织凋亡率 |
| 2.2.14 IHC测定Cleaved-caspase3表达量 |
| 2.2.15 WB检测蛋白量的多少 |
| 2.2.16 免疫共沉淀测定蛋白互作 |
| 2.2.17 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 H_2O_2 刺激H9c2 心肌细胞可以引起PHLDA1 表达增加 |
| 3.2 过表达PHLDA1 加重氧化应激诱导的H9c2 心肌细胞损伤 |
| 3.3 敲减PHLDA1 减轻氧化应激诱导的H9c2 心肌细胞损伤 |
| 3.4 敲减PHLDA1减轻离体心脏缺血再灌注损伤 |
| 3.5 Bax被鉴定为PHLDA1 新的结合蛋白并且在氧化应激情况下结合增强 |
| 3.6 PHLDA1 通过蛋白酶体途径调节Bax稳定性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本文创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）P38MAPK抑制剂、雌二醇和TPX2对痴呆鼠模型海马神经细胞损害的保护作用及认知功能的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 中文部分 |
| 第一部分 雌二醇治疗对小鼠阿尔茨海默病模型海马神经元发生及认知功能障碍的早期保护作用 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 P38MAPK抑制剂对血管性痴呆大鼠海马细胞凋亡的保护作用及学习记忆能力的影响 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 TPX2对阿尔茨海默病模型大鼠神经细胞凋亡的保护作用机制的研究 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文部分 |
| Chronic estradiol administration during the early stage ofAlzheimer's disease pathology rescues adult hippocampalneurogenesis and ameliorates cognitive deficits in Ap"2 mice |
| Introduction |
| Materials and Methods |
| Results |
| Discussion |
| Summary |
| Reference |
| Figure legends |
| The Effect of P38MAPK Inhibitors on Hippocampus Apoptosisand Learning Memory Ability in Vascular Dementia Rat |
| 1. Introduction |
| 2. Materials and Methods |
| 3. Results |
| 4. Discussion |
| Conflict of Interests |
| Authors, Contribution |
| Reference |
| Figure legend |
| Protective Effects and Mechanism Researches of TPX2 onNeurocytes Apoptosis of Rats with Alzheimer's Disease Model |
| Introduction |
| Materials and methods |
| Results |
| Discussion |
| References |
（9）瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠神经保护作用和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 瑶医源流及诊治法简述 |
| 1.1.1 瑶医药的形成和起源背景 |
| 1.1.2 瑶医药总体的特点 |
| 1.1.3 瑶医药的理论体系 |
| 1.1.4 瑶医诊治法简述 |
| 1.1.5 瑶医诊疗特色 |
| 1.1.6 瑶医药发展现状及存在问题 |
| 1.1.7 应对措施和建议 |
| 1.1.8 总结和展望 |
| 1.2 瑶医神火灸介绍及其临床应用 |
| 1.2.1 瑶医神火灸简介及作用原理 |
| 1.2.2 瑶医神火灸的作用及主治 |
| 1.2.3 神火灸的制备方法 |
| 1.2.4 瑶医神火灸药枝常用药物及功效[27] |
| 1.2.5 操作方法 |
| 1.2.6 神火灸与其他灸法的异同之处 |
| 1.2.7 临床应用举偶 |
| 1.2.8 瑶医神火灸治疗脑卒中及其并发症 |
| 1.2.9 总结 |
| 第二章 实验部分 |
| 实验一 瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠脑保护作用的研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 实验二 瑶医神火灸对脑缺血再灌注大鼠氧化应激、炎症因子及细胞凋亡的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 实验三 瑶医神火灸介导NF-κB通路对缺血再灌注大鼠保护作用的机制研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（10）高糖环境下17β-雌二醇抑制大鼠髓核细胞凋亡和促进胞外基质合成的作用及初步机制探讨（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 原代大鼠髓核细胞的体外分离培养及鉴定 |
| 引言 |
| 1. 实验材料和仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 第一部分 讨论 |
| 第一部分 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 17β-雌二醇对高糖环境下的大鼠髓核细胞凋亡及胞外基质合成的影响 |
| 一、17β-雌二醇对高糖环境下的大鼠髓核细胞凋亡的影响 |
| 引言 |
| 1. 实验材料和仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 二、17β-雌二醇对高糖环境下的大鼠髓核细胞胞外基质合成的影响 |
| 引言 |
| 1. 实验材料和仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 第二部分 讨论 |
| 第二部分 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 17β-雌二醇通过雌激素受体β抑制高糖状态下大鼠髓核细胞内氧化应激损伤 |
| 引言 |
| 1. 实验材料和仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 第三部分 讨论 |
| 第三部分 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 代谢综合征与椎间盘退变关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 雌激素及其受体对椎间盘退变的影响 |
| 参考文献 |
| 英文缩写注释表 |
| 攻读博士学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
四、17-β雌二醇对大鼠脑缺血再灌注后Bcl-2表达的影响（论文参考文献）
- [1]荭草苷对脑缺血再灌注大鼠脑组织线粒体自噬的作用及机制研究[D]. 贾冬雪. 河北北方学院, 2021(01)
- [2]基于PI3K/AKT信号通路探讨鹿茸多肽改善轻度认知功能障碍的作用机制研究[D]. 刘玥欣. 长春中医药大学, 2021(01)
- [3]雌激素对血管性痴呆大鼠认知功能及凋亡自噬相关蛋白和Wnt/β-catenin信号通路的影响[D]. 杨艳艳. 河北医科大学, 2021
- [4]针刺调控神经细胞自噬与凋亡以延长脑梗死溶栓时间窗的研究[D]. 张智慧. 南京中医药大学, 2021(01)
- [5]PI3K/Akt通道在七氟烷后处理脑缺血糖尿病大鼠神经保护作用的研究[D]. 张华朋. 山东大学, 2020(10)
- [6]全脑缺血再灌注损伤后神经保护新策略及其机制研究[D]. 孙大伟. 上海交通大学, 2020(01)
- [7]PHLDA1在H2O2诱导的H9c2心肌细胞损伤和心肌缺血再灌注损伤中的机制研究[D]. 郭雨萱. 中国医科大学, 2020(01)
- [8]P38MAPK抑制剂、雌二醇和TPX2对痴呆鼠模型海马神经细胞损害的保护作用及认知功能的影响[D]. 梁克山. 山东大学, 2019(02)
- [9]瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠神经保护作用和机制研究[D]. 周哲屹. 广州中医药大学, 2019(08)
- [10]高糖环境下17β-雌二醇抑制大鼠髓核细胞凋亡和促进胞外基质合成的作用及初步机制探讨[D]. 杨迪. 苏州大学, 2019(04)