一、肝癌及肝硬化患者血清HBV X基因检测及序列分析（论文文献综述）
王松姣[1]（2021）在《PCR产物直接测序检测HBV逆转录酶区耐药突变方法的建立及临床应用》文中提出慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染影响全世界约2.57亿人,并且是引起乙型肝炎肝硬化、肝细胞癌等肝脏疾病的主要原因。临床上常使用核苷（酸）类似物（NAs）)来抑制病毒复制,但是耐药性病毒株的选择常常会导致治疗失败和疾病的进展。而且,耐药性的发展始于HBV聚合酶基因的突变,随后数周至数月后病毒载量和血清丙氨酸氨基转移酶水平升高。因此,抗HBV耐药性突变的检测对于迅速制定新的治疗方案至关重要。第一部分乙型肝炎病毒逆转录酶区耐药突变检测方法的建立与评价目的本研究探讨建立一种检测HBV逆转录酶区10个经典耐药位点的PCR产物直接测序方法。方法1建立检测HBV逆转录酶区耐药突变的PCR产物直接测序方法根据HBV逆转录酶区常见的突变位点,采用Primer Premier 6.0软件设计了覆盖HBV基因型B和基因型C的逆转录酶区rt169至rt250位点的通用引物。以慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA作为模板进行PCR扩增,然后通过琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序分析PCR产物,以验证目的基因是否被扩增成功。2包含HBV逆转录酶区rt169至rt250位点的标准质粒的构建通过掺入Eco RI和Hind III限制性酶切位点的引物扩增HBV DNA模板,然后分别用限制性内切酶Eco RI和Hind III消化纯化的PCR产物和p UC19克隆载体。在使用T4 DNA连接酶将这两个酶切后的DNA片段的磷酸二酯键连接在一起之后,下一步是将重组质粒DNA转化至大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中。然后进行菌落PCR筛选和质粒DNA测序分析,以确定重组质粒标准模板是否构建成功。3 PCR产物直接测序法的评价将得到的重组菌株扩大培养,并对提取的质粒DNA进行定量和倍比稀释。以各浓度梯度的标准质粒作为DNA模板,重复PCR扩增3次。然后通过1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物,以目的条带检出率为100%时的最高和最低模板浓度分别作为该方法的检测上限和下限。通过建立的PCR方法对经Sanger测序验证的rt M204I突变标本连续重复检测10天,分析该耐药位点的突变检出率,以评价该方法的重复性。依据分子克隆方法构建rt M204I突变型重组质粒,将突变型质粒DNA按一定比例混合到野生型质粒中;对混合DNA模板进行PCR扩增,然后应用Mutation Surveyor软件对测序结果进行比对分析,以评价该方法对耐药突变株的检测灵敏度。分别对感染了人巨细胞病毒、人乳头瘤病毒、梅毒螺旋体患者和正常受试者的血清DNA样品以及用作空白对照和阳性对照的蒸馏水和质粒标准品进行PCR扩增和目的条带的检测,以评价该方法的特异性。结果（1）通过优化PCR扩增体系和条件,建立了一个标准化的PCR方案以检测HBV逆转录酶区的耐药突变位点。50μL PCR扩增体系为:蒸馏水33μL,20 mmol/L 10×扩增缓冲液（Mg2+plus）5μL,4种d NTP混合物（每种浓度为2.5 mmol/L）4μL,Ex Taq聚合酶（5 U/μL）1μL,上游引物（10μmol/L）1μL,下游引物（10μmol/L）1μL,模板DNA 5μL（<500 ng）。PCR扩增条件为95℃预变性5 min;94℃变性10 s,55℃退火20 s,72℃延伸1 min;循环40次;最后72℃延伸5 min。（2）通过分子克隆技术成功构建了包含有HBV逆转录酶区rt169至rt250位点的野生型标准质粒。（3）该方法对血清HBV DNA的检测范围为0.36 copies/μL至2.88×1011 copies/μL,联合应用Mutation Surveyor软件可检测出含量低至5%的耐药突变株。同一样本重复10次PCR扩增和测序分析,rt M204I的突变检出率为100%。在空白对照和HBV DNA阴性标本中均未检出目的条带。结论本课题所建立的PCR产物直接测序法能够同时检测HBV逆转录酶区rt169至rt250间的耐药突变位点,具有检测下限低、重复性好、特异性高、简单快捷的特点,联合应用Mutation Surveyor软件可提高对低含量耐药变异株检测的灵敏度。第二部分PCR产物直接测序法检测HBV耐药变异的临床应用目的HBV耐药源于长期使用核苷（酸）类似物（NAs）抗病毒治疗过程中HBV逆转录酶（RT）发生突变。到目前为止,这些突变在治疗过程中如何分布和进化的特征还没有被阐明。因此,本研究旨在通过上述建立的PCR产物直接测序法对未接受过治疗和接受过NAs治疗的CHB患者中HBV耐药变异和基因型进行检测,以分析CHB患者RT区突变是否受不同基因型的影响。方法应用PCR产物直接测序法对450例慢性乙型肝炎患者的HBV逆转录酶区耐药性突变进行分析,并通过系统进化树鉴定相应的HBV基因型。结果408例患者的HBV逆转录酶基因序列扩增成功。系统发育分析显示,HBV基因型B占优势。408例患者的序列分析显示,仅在NAs治疗过的患者中检测到经典的耐药突变位点,且耐药率较高（46.90%,106/226）。HBV基因型B和C患者中仅rt A181T/V突变率存在显着差异,其它经典耐药位点突变率无明显差异。在HBV RT区其它位点的突变率方面,发现了9个基因型相关的氨基酸多态性位点（rt191、rt214、rt221、rt222、rt223、rt224、rt226、rt229和rt238）。其中,大多数位点在未接受治疗的患者中具有较高的突变率（P<0.05）。结论HBV基因型B和C之间存在一定程度的遗传变异,但HBV基因型在抗病毒药物使用过程中驱动耐药性变化的作用有限。
李茂仕[2]（2021）在《血清HBV RNA在慢性HBV感染者病情评估和耐药监测中的应用》文中研究指明背景及目的:慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球性的公共卫生问题,肝细胞内的共价闭合环状DNA（ccc DNA）是HBV难以彻底清除进而引起不同临床结局的根本原因,但因检测需依赖肝活检而难以临床普及;虽然外周血中无法直接检测ccc DNA,但可通过其他血清指标来反映ccc DNA的变化。目前,核苷（酸）类似物（NAs）是主要的抗HBV治疗手段,但并不能直接清除ccc DNA,绝大部分的慢性HBV感染者均需长期用药。尽管高耐药屏障NAs使用后发生耐药的几率较前大为减少,但因HBV突变的必然性和复杂性,耐药株的出现实际上是NAs长期治疗不可避免的临床问题。不同于乙型肝炎表面抗原（HBs Ag）和HBV DNA,HBV RNA仅由ccc DNA转录产生且不受NAs治疗的影响,可较为真实反映肝内ccc DNA的表达情况。然而,HBV RNA检测尚无公认的标准化检测方法,其在慢性HBV感染者病情评估以及在NAs治疗耐药监测中的临床价值尚缺乏针对性研究。我们首先使用微滴数字PCR（dd PCR）技术建立了定量检测血清HBV RNA的方法,并使用商业化的实时荧光定量PCR方法进行对比评估以确保检测结果的准确性。然后我们观察了未治的慢性HBV感染者不同临床表型的血清HBV RNA水平,并追踪分析了恩替卡韦初治但在随访过程中发生了基因型耐药（GR）和部分病毒学应答（PVR）患者血清HBV RNA的动力学特征以及耐药突变情况,以期为血清HBV RNA应用于慢性HBV感染者病情评估以及监测耐药突变提供新的依据。方法:1.获取治疗和未治疗的慢性HBV感染者的血清各32例,平行使用dd PCR和商品化的q PCR方法检测血清HBV RNA水平,使用直线回归分析和Bland-Altman分析两种方法的相关性和一致性;以1例高浓度的HBV RNA样本进行梯度稀释,两种检测方法平行进行测定,每个梯度重复5次以明确两种方法的重复性,敏感性。2.根据常见临床指标将149例未治的慢性HBV感染者分为HBe Ag阳性伴ALT正常（EPNA）、HBe Ag阳性伴ALT升高（EPEA）、HBe Ag阴性伴ALT正常（ENNA）、HBe Ag阳性伴ALT升高（ENEA）等4种临床表型。使用q PCR法检测血清HBV RNA水平并在血清HBV DNA或/和HBV RNA阴性的患者中实施肝活检。使用单因素logistics回归分析探讨HBe Ag阴性患者中与ALT升高相关的危险因素。3.以31例HBe Ag阴性、HBV DNA阳性、ALT正常或者轻度异常（<2倍正常参考值上限,ULN）的未治慢性HBV感染者为研究对象,检测其血清HBV RNA水平,肝活检Scheuer评分系统对肝脏炎症评分（G）≥2判定为显着性肝炎,以受试者工作曲线（ROC）探讨血清HBV RNA水平在鉴别显着性肝炎中的价值。4.在我院肝炎数据库中筛选出5例ETV初治的慢性乙型肝炎（CHB）患者,其中包含了在持续抗病毒治疗过程中被检出GR的患者3例以及未检出耐药的PVR患者2例。耐药突变的信息是采用一代测序针对血清HBV DNA检测得到。调取生物样本库中该患者从初治到随访终点之间的血清样本,以dd PCR方法检测血清HBV RNA水平,观察其与HBs Ag、HBV DNA动态变化的特征,并使用三代测序技术（TGS）对部分随访点的血清HBV RNA的反转录区进行耐药突变的长期监测。结果1.两种血清HBV RNA检测方法在未治疗组和治疗组中的直线回归系数（R2）分别为0.912和0.874,95%一致性界限分别为（-1.430,1.506）和（-1.533,1.648）。梯度稀释实验显示dd PCR法和商品化的q PCR法在血清HBV RNA≥2.0 log10 copies/m L时检出率均为100%,CV值分别介于2.29%～10.8%和3.11%～7.33%;但在血清HBV RNA<2.0 log10 copies/m L时,随着梯度稀释倍数的增加,检出率逐渐下降,最低检测下限（LLo D）分别约为61 copies/m L和15 copies/m L。dd PCR法和商品化的q PCR法在HBV RNA可测结果和稀释倍数之间存在显着性线性相关,R2分别为0.895和0.938,P<0.0001。2.EPNA、EPEA、ENNA和ENEA四种临床表型的可测血清HBV RNA水平(log10copies/m L)分别为6.02±1.48、6.54±1.27、2.51±0.78和3.54±1.25。HBV RNA低水平(<2.0 log10 copies/m L)中以ENNA表型为主（76.9%）,高水平(>6.0 log10 copies/m L)中以HBe Ag阳性表型（EPNA和EPEA）为主（98.1%）。在EPNA、EPEA和ENEA中,血清HBV RNA与血清HBV DNA显着正相关,相关系数（r）分别为0.868(P=9.480×10-9)、0.687(P=2.621×10-8)、0.769(P=6.686×10-9),但在ENNA表型中,两者没有显着性相关关系（r=0.324,P=0.075）。在EPNA、EPEA表型中,血清HBV RNA与HBs Ag呈现显着正相关,相关系数分别为0.777(P=2.999×10-6)和0.637(P=4.993×10-7),但在HBe Ag阴性表型中则无此显着相关性。血清HBV DNA和HBV RNA水平均是与HBe Ag阴性患者ALT升高相关的独立危险因素,比值比（OR）分别为2.650（1.640～4.282）,P=6.823×10-5和2.570（1.541～4.286）,P=2.971×10-4。血清HBs Ag水平则处于接近于显着性的状态（P=0.053）。7例血清HBV DNA阴性,但RNA阳性的患者肝组织活检均显示为中度或重度肝脏炎症（G≥2）。3.血清HBV RNA水平具有鉴别HBe Ag阴性、DNA阳性、ALT正常或者轻度异常（<2×ULN）患者显着性肝炎的能力,受试者工作曲线下面积（AUC）为0.737（0.549,0.925）,P=0.029,而HBV DNA则不具有这种能力（P=0.248）。根据最大优登指数得出HBV RNA用于鉴别肝脏显着性炎症的最佳截断值为2.81 log10 copies/m L,此时敏感度73.7%,特异度66.7%,准确度71.0%。4.患者GR1、GR2和GR3分别在其抗病毒治疗第208、186及142周时检测出了耐药突变,在这时间点之前,3例患者血清HBV RNA持续>4.0 log10 copies/m L。2例PVR患者在我们观测的抗病毒治疗期间HBV RNA持续>6.0 log10 copies/m L。患者GR1和GR2在换用或者加用TDF之后,血清HBV RNA水平分别在此之后的26、22周时下降了1.63 log10和2.58 log10,HBV DNA水平则分别从4.40 log10和3.44 log10均降至LLo D,而HBs Ag则几乎没有变化(分别上升0.03log10和下降0.02log10)。3例GR患者和2例PVR患者的血清HBV RNA的RT区耐药位点突变结果与HBV DNA的耐药位点检测结果是一致的。利用三代测序技术对HBV RNA RT区长期监测发现,患者GR1和GR3在耐药发生之前没有观测到常见耐药位点的突变,而GR2患者则从初治开始就具备rt L180M+M204I突变。结论:1.我们使用dd PCR建立的方法和q PCR方法均是可靠的血清HBV RNA定量检测方法,低浓度血清样本的检出是困难的,但可以增加重复检测次数来改善;2.血清HBV RNA在不同临床表型中的水平存在差异,提示血清HBV RNA可以用于未治慢性HBV感染者病情的评估。血清HBV RNA与血清HBV DNA均是未治HBe Ag阴性患者ALT升高的独立危险因素,因此在血清HBV DNA阴性患者中检测HBV RNA是必要的,血清HBV RNA可补充HBV DNA用于反映肝脏炎症;3.在未经治疗的正常或者轻度ALT异常（ALT<2×ULN）的HBe Ag阴性患者中,血清HBV RNA可以用来判定肝脏炎症程度但HBV DNA不具备这样的能力,因此这部分患者可通过血清HBV RNA水平作为启动抗病毒治疗的依据;4.血清HBV RNA水平以及利用HBV RNA测序分析适合用于长期监测慢性乙型肝炎患者NAs抗病毒疗效和基因耐药突变的发生。总之,血清HBV RNA作为一个病毒学指标,可在血清HBV DNA阴性或者ALT<2×ULN的未治HBe Ag阴性患者中用于肝脏炎症的评估;血清HBV RNA也适合用于持续NAs治疗患者抗病毒疗效的评估以及耐药突变的长期监测,进而帮助临床医师为患者制定个体化管理和治疗策略提供参考依据。
刘贺[3]（2020）在《青藏高原藏族人群乙型肝炎病毒全基因组突变分析及时空动力学研究》文中认为目的:分析乙型肝炎病毒（HBV）CD重组体的遗传变异情况;探寻藏族人群HBV感染者血清中表面抗原（HBsAg）和抗表面抗原抗体（HBsAb）双阳性发生率及原因;分析HBV/CD重组体的时空动态传播过程和进化遗传学特征（包括基因序列起源、核苷酸替换率和居群动力学等）。方法:利用多阶段随机抽样的方法,在西藏自治区和青海省海南州进行社区藏族人群血清样本采集,西藏七个地市中共收集HBsAg阳性血清样本852例,青海省收集HBsAg 阳性血清样本411例。按照采样地区藏族人群人口分布情况,选取具有代表性的血清样本进行DNA提取,分别对HBV全长和BCP区采用巢式PCR方法进行扩增、测序和拼接,以获得HBV全序列。对获得的全序列进行重组分析,对不同重组型的基线情况、遗传变异、血清型进行比较;对重组体内不同基因型片段进行系统发育分析。以青藏高原藏族人群HBsAg和HBsAb双阳性血清样本做为观察组,并以1:4配比选择年龄、性别、病毒DNA水平和HBeAg状态同质的HBsAg 阳性/HBsAb阴性血清样本作为对照组,对两组间基因序列S区、PreS区氨基酸突变率、缺失和全基因组核苷酸突变位点分布情况进行比较。使用自NCBI中检索、收集的HBV C2亚基因型、D基因型和CD重组体全长序列,合并本研究中获得的185株全长序列,构建数据库。使用BEAST软件包对CD重组体中的D基因型片段和D1-5亚基因型;CD重组体中的C基因型片段和C2亚基因型分别进行系统发生生物地理学分析。同时,对CD1和CD2全长序列单独进行溯祖分析,并使用贝叶斯skyline重建方法推断种群数量的历史变化。结果:共获得185条HBV全长序列,其基因分型主要为CD重组基因型（181/185,97.84%）,包括:132株CD1型,其nt10-799为D基因型,其余部分为C基因型;49株CD2型,其nt10-1499为D基因型,其余部分为C基因型;除CD重组型,还获得了 4株C2亚基因型序列。185株测序样本中,HBeAg阳性组的病毒DNA水平高于HBeAg阴性组（P=0.001）;HBeAg阴性组年龄高于HBeAg阳性组（P=0.006）。CD1和CD2的C基因型区域均与C2亚基因型最为接近;CD重组体的D基因型段（nt10-799）与D4亚基因型最为接近,而CD2型nt800-1499序列在系统发育树中与D1-D3更为接近。CD2型重组体主要分布于与印度接壤的山南地区和日喀则市（P=0）。CD重组体在S区氨基酸aa76、aa120和aa129与D基因型存在差异。HBV/CD重组体的主要血清学型为ayw2型（175/181,96.7%）。与CD1型相比,CD2型存在较多的S207N突变。HBV/CD重组体的T1762/A1764双突变发生率低于C基因型,与D基因型接近。HBV/CD病毒株的 G1896A（11.1%vs 25.6%）和A2189C（11.1%vs 50.0%）突变频率低于 C2基因型,G1613A（8.9%vs 10.3%）突变水平与C2基因型相近。青藏高原1263份HBsAg阳性样本的双阳性率为2.14%（27/1263）。在S蛋白全长、N端,MHR（aa100-169）,“a”决定簇（aa124-147）,茎环结构第一环（aa124-137）,第二环（aa139-147）和C端的氨基酸突变率,双阳性组均显着高于对照组;双阳性组中PreS区缺失显着高于对照组（以上结果中,均为P<0.001）。PreSI和PreS2氨基酸突变率在两组间无显着性差异（P=0.19;P=0.89）。PreC/C区C2002T、A2159G、A2189C、C2198A在两组间的分布均存在显着差异。双阳性组和对照组的核苷酸点突变比较,PreS/S区C3189A和T825C、P区C930A在两组间分布存在显着性差异。其中,PreS区C129T（S155L）仅存在于对照组;PreS区C3189A（D103E）和S区T825C（V224A）突变仅存在于双阳性组。HBVD基因型和CD重组体中的D型区域（nt10-799）可溯祖至271年前（95%HPD 138-477）的亚洲南部,其平均进化速率约为1.26×104（95%HPD 5.92×10-5-1.93×10-4）/位点/年。D4亚基因型是CD1和CD2中最为接近的分支,于1850年左右（95%HPD 1743-1934）进入青藏高原;1911年左右（95%HPD 1845-1971）分化为CD1和CD2内相应片段。CD1型较CD2型出现更早,表明先形成D基因型区段为nt10-799的CD1,后续形成D基因型区段为10-1499的CD2。HBV/CD1和HBV/CD2重组体分别形成三个独立的进化群。HBV/CD1重组体自1980年代开始至2000年,其种群大小保持稳定;HBV/CD2重组体自1997年首次报道以来,其种群大小经过短暂上升之后,随即出现了明显的下降趋势。全球C2亚型片段的传播最先起源于亚洲东部,首先传播到中国西北和亚洲北部,随后东亚分离株又进一步播散到美洲。结论:HBV/CD重组体是高原地区流行的主要基因型。HBeAg阴性组患者体内重组体DNA水平更高,病毒复制速度较快,病情处于进展期。年龄增长是导致HBeAg在感染HBV/CD的藏族人群血清中发生转阴的主要原因。HBV/CD1重组来源为D4和C2亚基因型;HBV/CD2可能经过重组来源为D1-3、D4和C2亚基因型的多次重组。基于各基因型的地理分布,形成CD重组体的主要重组来源可能为中国（C2亚基因型）和印度（D4亚基因型）。与D基因型相比,HBV/CD重组体的主要血清型无明显变化。HBV/CD重组体感染者均在高海拔地区生活,造成这种现象的可能原因是高原居民具有相近的遗传背景特征或长期的高海拔生活导致其具有相同或相似的生活习惯。青藏高原HBV表面抗原阳性人群中HBsAg和HBsAb双阳性的发生率接近大多数不同基因型的既往研究结果。与对照组相比,双阳性组的氨基酸突变率在S区全长及其内的各个区段均显着增加。S区高突并不是血清双阳性病的充分必要条件,并不能完全解释HBsAg/HBsAb共存现象,PreS区的改变可能是导致HBsAg/HBsAb双阳性的因素之一。S区T825C（V224A）、PreS区C3189A（D103E）仅存在于双阳性组中,这些氨基酸变异导致蛋白结构发生变化,可能是双阳性发生的重要条件。HBVD基因型最可能的起源地是南亚地区。D基因型原型株在18世纪中叶逐步从印度传播到中亚进而传播到欧洲、地中海地区和非洲。在此过程中,19世纪中叶先后分化出D1、D3和D2亚基因型。同时19世纪中叶自印度向东北方向传播,逐步形成D4亚基因型并在1910年左右进入青藏高原及周边地区与C2型发生重组,这与英军两次入侵西藏时间相吻合。欧洲主要HBV D亚型的传播可追溯到二十世纪早期,包括第一次世界大战特别是第二次世界大战在内的一段时期。此过程可能与战争中产生的创伤、输血和疫苗注射,以及有组织的大规模人口迁移导致HBV的快速传播和演化有关。C2基因型向美洲等地的播散则与亚洲在二十世纪八九十年代的欧美移民潮有关,随着大量东亚地区亚裔人口向欧美等发达国家移民导致C2亚基因型的世界范围传播。
刘莹[4]（2020）在《云南地区少数民族中HBV的流行和HBV pgRNA检测方法的建立与评价》文中研究指明乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）属嗜肝DNA病毒科,是一种带有包膜的小型环状部分双链（ds）DNA病毒。HBV感染是导致慢性乙型肝炎（CHB）、肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌（HCC）的主要致病因素,对人类的健康造成很大威胁。由于不同基因型和亚型对乙肝患者存在致病性和治疗效果的差异,云南具有独特的地理位置和多民族聚集的地域特征,针对云南少数民族人群开展HBV的分子流行病学研究为乙型肝炎的治疗和控制具有重要意义。此外,近期研究发现HBV Pg RNA是HBV ccc DNA的直接转录产物,能够通过反映HBV ccc DNA的转录活动状态进而反映慢性乙型肝炎病情进展,从而指导临床治疗和判断预后。然而,目前针对HBV pg RNA的检测方法研究较少且该方法还未推广应用到临床。基于此本论文针对云南地区八个少数民族的普通人群进行了HBV流行病学调查并建立了HBV pg RNA的检测方法以及该方法的评价。首先,针对普通人群我们采集了云南地区五个少数民族（佤族、布朗族、哈尼族、纳西族、普米族）共计2696例血浆样本,利用Elisa方法检测发现,HBs Ag总体阳性率为7.6%（204/2696）,其中普米族感染率最高为15.4%（58/376）、哈尼族7.6%（37/487）、佤族7.4%（66/896）、布朗族5.4%（25/464）、纳西族4.9%（23/473）。针对204例HBs Ag阳性样本,我们利用HBV S基因进行基因型和亚型分析,结果显示该人群中HBV亚型分布为B2（48.6%）、C1（34.2%）、B4（13.9%）、C2（0.7%）、C5（0.7%）、和4.9%（10例）未确定基因亚型。为了进一步比较不同少数民族中HBV亚型分布差异,我们还收集了206例包括三个民族（傣族、彝族和汉族）乙肝肝病血液样本,经基因亚型分析显示,该人群中HBV亚型分布为B2（29.6%）、C1（29.1%）、C2（23.3%）、B1（0.5%）、B4（0.5%）以及35个未分型样本。经统计分析发现,哈尼族以B2（75%）为主,普米族以B2（38.6%）和C1（43.9%）亚型为主,纳西族以C1（47.1%）亚型为主,彝族以基因型B2（32.69%）和基因型C1占（38.46%）亚型为主,傣族以基因型C1（67.35%）为主,汉族以基因型B2（30.48%）和C2（36.19%）为主。其次,为了进一步分析上述45例未分型样本的基因特征,我们进行了HBV全基因组序列的扩增,其中我们成功获得了39例HBV全基因序列,经序列分析发现8例属于B/C重组,1例B/I重组。7例属于潜在B新亚型,6例属于C型新亚型,其余16例属于不同亚型。为了进一步命名这些新的HBV亚型,基于HBV全基因组序列我们分别进行了HBV遗传距离分析、同源关系进化树分析、基因重组分析、以及特异性氨基酸突变分析,分析发现这些样本符合HBV基因亚型的命名规则,因此我们将它们命名为B10和C17亚型。最后,我们针对HBV Pg RNA5’和3’端序列的特征,分别建立了两种HBV Pg RNA荧光定量PCR检测方法,经特异性、灵敏性、重复性分析发现针对HBV5’端序列建立的Pg RNA的检测方法特异性更好、灵敏度更高。此外,我们选择了40例临床HBV样本就我们建立的HBV Pg RNA检测方法进行评价,结果显示,慢乙肝样本中HBV Pg RNA含量明显高于乙肝肝癌样本,该结果与临床表现相符与相关文献报道一致,该结果表明我们建立的HBV Pg RNA的方法具有潜在的临床应用价值。综上所述,本研究阐明了HBV在云南地区八个民族中基因型和亚型的分布情况并比较了不同民族之间基因型的差异,揭示了云南地区不同民族HBV基因型的复杂性和多样性。同时我们还建立和评价了两种HBV pg RNA荧光定量的检测方法,为今后HBV的研究提供了重要的理论依据,同时也为临床样本的诊断提供了一种更加方便、灵敏的检测方法。
顾霜霖[5]（2020）在《使用结构生物信息学方法研究HBV突变在肝癌免疫逃逸中的作用》文中进行了进一步梳理HBV（Hepatitis B virus）感染是威胁我国乃至全球人民健康的一个重要问题,长期处于宿主肝细胞和免疫细胞的选择压力下,HBV病毒可能发生自发突变,改变病毒产生的抗原肽与MHC I（major histocompatibility complex class I）类分子的结合力,降低MHC I类分子对抗原肽的递呈,从而导致免疫逃逸。不同种族人群可能易感不同基因型的HBV病毒株,故本课题在大数据的背景下,选择中国人群高频出现的HLA-A*11:01（human lymphocyte antigen）亚型和欧美人群中高频出现的HLA-A*02:01亚型,同时收集亚洲人群和欧美人群易感的HBV亚型及其编码主要抗原的C和S编码区序列。在欧美人群易感的A亚型中,在C编码区收集到1086条病毒序列,S编码区收集到1390条病毒序列,而亚洲人群易感的B、C亚型中在C编码区分别收集到1573和2115条序列,S编码区分别收集到2581和2639条病毒序列。再通过对HBV病毒序列进行对比,保守性,理化性质,预测抗原肽打分等生物信息学手段分析,筛选到21个候选关键突变。接着基于关键突变,通过分子对接构建其产生的预测抗原肽与MHC I类分子的复合体结构,再对肽-MHC复合体使用氨基酸扫描分析筛选出11个会对抗原肽与MHC分子之间亲和力造成影响的突变,分别为:I155V,V149A,L149V,I156L,L213F,I256M,V351A,V354A,M372V,M372I,L389V。并使用分子动力学方法计算并比较复合体突变前后整体结合自由能产生的变化,计算结果显示这11个突变都会导致结合自由能不同程度的下降,其中L149V的突变对结合自由能的影响最大,由原本的136.52kcal/mol将至68.10kcal/mol,下降幅度高达50%,表明该位点的突变使其相应的抗原肽和MHC之间的结合力减弱。本研究发现了在中国和欧美人群高频出现的HLA-A*11:01和HLA-A*02:01亚型中,HBV病毒在C和S编码区的关键突变将会影响对其产生的突变抗原肽与相应MHC之间的亲和力,故推测候选的关键突变基因将会导致机体的免疫逃逸,可能与HBV感染相关的肝癌发生有关。
范晶华[6]（2019）在《慢性乙肝病毒感染者核苷（酸）类似物长期抗病毒治疗疗效与乙肝病毒准种异质性及进化机制研究》文中研究表明[目 的]前期研究聚焦早期准种变化对短期（一般3年或以下）抗病毒治疗疗效的影响。本研究前瞻性观察慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者（慢性乙型肝炎及乙肝病毒相关肝硬化患者）核苷（酸）类似物（NAs）长期（近10年）抗病毒治疗过程中的疗效及对临床结局的影响,研究抗病毒治疗关键时间节点的乙型肝炎病毒准种异质性及其进化机制,进一步明确抗病毒治疗效果差异的病毒学机制。[方法]本研究的第一部分纳入107例接受核苷（酸）类似物治疗的慢性HBV感染者开展为期111.83月的前瞻性、开放性、观察性的真实世界研究。入组患者随机分为恩替卡韦组（治疗药物为恩替卡韦）和非恩替卡韦组（治疗药物为拉米夫定、阿德福韦酯或替比夫定）。每24～48周进行一次随访,收集患者临床资料,分析长期抗病毒治疗后病毒学、生化及血清学应答情况及对临床结局的影响。本研究第二部分采用第一部分的24例慢乙肝患者进行HBV准种研究。首先,我们将研究对象分为三组（三组间无配对关系）,即未治疗组、治疗1年组和治疗10年组（病毒学突破组）,分别取不同时期的患者血清进行HBV准种研究。对于治疗1年组,我们根据患者治疗1年以后病毒应答的时间情况,分为A组（1年<HBV应答时间<3年）和B组（3年<HBV应答时间<6年）。采用PCR产物克隆测序的方法对逆转录酶（reverse transcriptase,RT）区准种进行分析,比较不同治疗时间点的HBV准种差异,探讨核苷（酸）类似物治疗1年时HBV准种的特征与之后病毒学应答的关系及RT基因的准种进化规律。本研究第三部分对一例乙肝病毒表面抗原（Hepatitis B surface Antigen,HBsAg）和抗-HBs共存的HBV准种基因组进行克隆、测序、生物信息学比较及荟萃分析。[结 果]第一部分:经过长期NAs抗病毒治疗,HBVDNA的对数值（log10 IU/mL）治疗后降为 1.28（1.28,1.40）IU/mL 低于治疗前的 6.92（5.06,7.89）IU/mL（P<0.05）,恩替卡韦组较非恩替卡韦治疗组下降幅度更大（P<0.05）。随访结束时,病毒学突破人数为28人,突破率为26.17%,恩替卡韦组与非恩替卡韦组无差异（P>0.05）。治疗1年时HBV DNA不可测为病毒学突破的保护因素（HR=0.235（0.103,0.538）,P<0.05）。67.9%患者 HBsAg 定量低于 1500 IU/ml,6.54%（7例）患者HBsAg消失并于治疗24～48周时获得早期病毒学应答。乙肝病毒e抗原（Hepatitis B e Antigen,HBeAg）消失率为 71.21%,血清转换率为 40.91%。患者HBeAg消失与基线HBV DNA、ALT水平、HBV DNA转阴时间无关（P>0.05）。6 例患者（5.61%,6/107）发生恶性肿瘤,其中 3 例（2.80%,3/107）发生肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）、均为恩替卡韦治疗患者。APRI指数治疗后为 0.44（0.31,0.56）,低于治疗前 1.05（0.53,1.75）（P<0.01）,随访结束后患者肝硬度值为4.9（4.0,6.2）KPa。第二部分:我们采用24例慢乙肝患者451条HBV RT克隆序列用于下游分析,研究不同抗病毒效果患者的病毒学机制,结果如下:1.A组40%（2例）患者检测到耐药突变,B组75%（6例）患者检测到耐药突变,治疗10年组50%（3例）患者检测到耐药突变。B组和治疗10年组均有50%的患者积累了插入、缺失或终止密码子突变。2.在RT基因的核苷酸和氨基酸水平,治疗1年组的复杂度均显着高于未治疗组（P<0.05）,而且治疗1年或10年组的平均遗传距离均显着高于未治疗组（P<0.05）。在RT基因的核苷酸水平,A组复杂度（Sn=0.9734）均显着高于 B 组（Sn=0.8875,P=0.0393）和治疗 10 年组（Sn=0.8524,P=0.0141）。A组和B组的平均遗传距离、平均同义替换数目及平均非同义替换数目水平相当,均低于治疗10年组,但无统计学意义（P>0.05）。在RT基因的氨基酸水平,A组复杂度（Sn=0.8874）显着高于治疗10年组（Sn=0.7098,P=0.0473）,但三组间的平均遗传距离无显着差异（P>0.05）。3.与治疗1年组（A组和B组）相比,未治疗组和治疗10年组的系统进化树具有较为简单的拓扑结构。治疗1年组（A和B组）平均枝长（0.0029±0.00029）显着大于未治疗组（0.0012±0.0003,P=0.0137）。A 组平均枝长（0.0028±0.0005）和 B 组的平均枝长（0.003±0.0004）均显着大于治疗10年组（0.002±0.0004）（P<0.001）,但A组和B组的平均枝长差异不显着（P=0.6368）。4.我们对三组患者HBVRT的选择压力（ω=dN/dS）进行分析。结果表明,三组患者HBV均经历了正选择,治疗10年组积累了更多的正选择信号。在基因型B、C及B/C中,三组患者具有相似的ω值分布趋势。在B/C基因型中,A组的选择压力（ω=0.296±0.0332）和B组的选择压力（ω=0.291±0.0469）没有差异,均低于治疗10年组（ω=0.5679±0.1722）。5.治疗1年时RT准种复杂度（核苷酸水平）与相应的HBV DNA载量呈负相关（P=0.0163,R=-0.6493）。RT的准种复杂度（核苷酸和氨基酸水平）与相应的ALT 水平呈负相关（P=0.0437,R=-0.5661;和 P=0.0117,R=-0.673）。平均遗传距离、平均同义替换数和平均非同义替换数与相应的HBV DNA载量、ALT水平无统计学相关性。第三部分:本研究分析1例HBsAg和抗-HBs共存的基因型为Ⅰ型的慢性乙型肝炎患者HBV准种基因组特征,该病毒准种基因组具有高度复杂的准种异质性和高频的HBsAg突变,其中69%的克隆发生PreS缺失和HBsAg氨基酸变异。Meta分析结果表明,PreS缺失与HBsAg和抗-HBs共存具有相关性,总体风险估值为 4.09（95%CI（2.18,7.68））。[结 论]NAs长期抗病毒治疗可以使患者不同程度获益,与HBV准种异质性密切相关。在抗病毒药物压力下,HBVRT准种的异质性与核苷（酸）类似物抗病毒治疗应答早晚有关,该基因的准种的高复杂度可能提示治疗应答佳。在治疗1年时,高复杂度的HBV准种,有利于HBV DNA和ALT水平下降,但低水平的ALT反而不利于HBVDNA清除。抗病毒治疗效果差的患者积累了较多的耐药突变、缺失、或终止密码子突变,提示这些突变不利于病毒学应答,可能与免疫逃逸有关。治疗10年组具有较为简单的进化模式与更多的正选择信号,提示这些变化可能与病毒学突破有关。个案HBV基因组准种分析与Meta分析表明,高频的preS1缺失,与HBsAg与抗-HBs共存相关。
杨咪[7]（2019）在《单独或联合HBsAg与HBV-DNA指标对原发性肝癌发病风险的预测作用》文中研究说明目的:明确血清HBsAg阳性患者不同水平乙肝表面抗原和病毒载量与肝癌发病风险的关系;并进一步阐述HBsAg单独或联合HBV-DNA定量预测肝癌的发病风险。方法:以2008年1月1日至2018年12月31日期间在南昌大学第一附属医院住院的200例确诊为肝癌,和同期传染科门诊中200例年龄及性别大致匹配、且首次诊断为血清HBsAg阳性的患者为研究对象。收集临床资料,包括实验室检验、影像学等数据。根据病例对照研究方式,筛选可能混淆研究结果的因素,相关混杂因素包括患者性别、年龄、肝癌家族史、吸烟或饮酒、乙肝五项、HBV-DNA水平、高血压、糖尿病等其他疾病史。所有研究数据均采用SPSS 19.0进行统计分析,分别运用卡方检验或Student’s t检验比较两组差异性;再进行单因素及多因素Logistic回归分析,得出相关因素的OR值及95%置信区间（CI）,P值<0.05有统计学意义。结果:1.单因素Logistic回归分析发现血清HBsAg阳性患者发生肝癌的相关危险因素包括:吸烟、饮酒、2型糖尿病、肝癌家族史、HBeAg阳性、HBsAg和HBV-DNA。2.多因素Logistic回归分析发现血清HBsAg阳性患者发生肝癌的相关危险因素包括:饮酒史（OR 2.53,95%CI:1.60-4.01）、肝癌家族史（OR 3.07,95%CI:1.44-6.51）、HBeAg阳性（OR 2.07,95%CI:1.32-2.23）、HBsAg（100-999IU/mL;OR 1.88,95%CI:0.94-3.77;1000-9999IU/mL:OR 3.30,95%CI:1.70-6.37;≥10000IU/mL:OR 3.66,95%CI:1.48-6.78）和HBV-DNA（103-105IU/mL:OR 1.64,95%CI:0.99-2.70;>105IU/mL:3.46,95%CI:2.03-5.88）。3.针对HBV-DNA水平分层分析发现HBV-DNA<103IU/mL中HBsAg≥100IU/mL水平的血清HBsAg阳性患者发生肝癌的风险增加39%（OR 1.39,95%CI:0.99-1.78）,而HBV-DNA≥103IU/mL中的HBsAg≥100IU/mL水平的血清HBsAg阳性患者发生肝癌的风险增加74%（OR 1.74,95%CI:1.31-2.26）。4.联合HBsAg与HBV-DNA最小或最大水平的分层分析发现HbsAg<100IU/mL且HBV-DNA<103IU/mL水平的血清HBsAg阳性患者发生肝癌的风险相对于其他血清HBsAg阳性患者降低了57%（OR 0.43,95%CI:0.22-0.84）,而HBsAg≥10000IU/mL且HBV-DNA≥105IU/mL水平的血清HBsAg阳性患者发生肝癌的风险为其他血清HBsAg阳性患者的4.10倍（OR 4.10,95%CI:1.86-9.06）。结论:本研究明确了饮酒、肝癌家族史、HBeAg阳性、HBV-DNA和HBsAg水平为血清HBsAg阳性患者发生肝癌的独立危险因素。我们发现单独或联合HBsAg和HBV-DNA定量指标的升高与肝癌的发病风险呈剂量-反应关系。在肝癌的发生风险预测中,HBsAg水平可能与HBV-DNA互补,并且将HBsAg和HBV-DNA水平联合更有助于临床工作人员预测血清HBsAg阳性患者发生肝癌的风险。
张宝芳[8]（2019）在《贵州地区高风险乙型肝炎孕妇母婴垂直传播阻断的真实世界回顾性研究》文中研究表明乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是一个影响全人类健康的主要公共卫生问题,乙型病毒肝炎是感染乙型肝炎病毒后引起的以肝功能损伤为主的全身性传染病,全球有20亿人血清学显示其曾感染过HBV,其中有3.5亿多人发展成为慢性HBV携带者,部分慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B,CHB）患者会死于乙型肝炎所致的肝硬化和肝癌,给病人、家庭、社会带来了沉重的经济负担。目前,我国育龄期妇女HBsAg流行率约为6.6%,估算每年仍有100万名新生儿出生后面临感染HBV的高风险。2016年发布的《全球卫生部门病毒性肝炎战略》首次提出到2030年消除病毒性肝炎对公共卫生威胁的全球性目标,而“HBV母婴零传播”是实现该目标的重要一环,因此,中国肝炎防治基金会建立“乙肝母婴零传播工程项目”,贵州医科大学附属医院为全国第6家签订完成该项目单位。本课题将回顾性分析研究贵州高风险乙型肝炎孕妇（HBsAg、HBeAg双阳性,H3V DNA≥106 IU/ml,或第一胎已被感染HBV或孕妇本人就为乙肝母婴传播感染者）,分为孕期药物干预组及门诊非干预组与对照组（非乙型肝炎孕妇）及其出生的新生儿/婴幼儿,研究干预组孕期HBV病毒基因型及免疫功能变化与对抗病毒药物作用影响,其所生新生儿/婴幼儿在乙型肝炎疫苗及乙型肝炎免疫球蛋白联合标准规范免疫接种后,HBV母婴传播感染率及产生抗-HBs滴度。针对母婴传播患者,通过二代测序分析,判断母婴病毒全基因序列同源性及发现有宫内传播优势的特异突变位点。为HBV母婴传播感染发生机制及防控提供临床真实研究数据。所有研究人群均通过贵州医科大学附属医院伦理委员会审核同意通过。研究内容分为三部分报告。目的:1.观察孕期使用抗病毒药物阻断对贵州地区不同基因型高风险乙型肝炎孕妇HBVDNA 及 HBVRNA 的影响。2.对贵州地区高风险乙型肝炎孕妇母婴传播阻断后母婴结局观察。3.探索乙肝病毒宫内感染的无创性产前诊断。方法:第一部分,回顾性收集2016年05月-2018年05月在贵州医科大学附属医院感染科及产科门诊,入选患者诊断符合2015年修订的《慢性乙型肝炎防治指南》[2]的诊断标准,在孕12周前就诊查确诊慢性乙型肝炎CHB患者孕妇,均为HBsAg（Hepatitis B surface antigen,HB sAg）阳性持续超过6个月,并在孕24周前B超检查提示胎儿发育正常,血清丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）、人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus,HIV）、梅毒螺旋体抗体（Treponema pallidum antibody,RPR）标志物阴性,无先兆流产史。排除标准:①丈夫有HBV感染;②孕前半年内有使用干扰素治疗CHB患者;③孕期伴有其他类型的肝病,糖尿病,甲状腺疾病,高血压、慢性肾病,肿瘤,精神类等慢性疾病史;④肝硬化失代偿期患者;⑤产前B超提示胎儿发育异常或畸形。根据孕24周-28周是否抗病毒阻断分为两组:干预组（T）91例,未干预组（NT）259例,同期我院产科门诊体检健康非乙型肝炎孕妇（Health control,HC,定义为HBsAg阴性,肝功正常,既往无肝炎病史）作为对照组（C）100例。按照乙肝孕妇抗病毒指南,干预组均以阻断为目的,自愿在24-28周开始接受服用替诺福韦或者替比夫定抗病毒治疗直至分娩。开展人口统计学和临床特征调查并分别于孕12-24周,孕28-32周,孕36-40周采集血液样本,检测基因型,HBsAg、HBeAg、HBVDNA、HBVRNA,肝功能[丙氨酸转氨酶（ALT）天门冬氨酸氨基转移酶（AST）总胆红素（TBIL）总胆汁酸（TBA）胆碱酯酶（CHE）碱性磷酸酶（ALP）及对照组,未干预组,干预组在用药前（孕12-24W）及干预组分娩前（36-40周）检测T淋巴细胞（CD3+,CD4+CD8+）,NK 细胞（CD16+CD56）及 B 淋巴细胞（CD19）的变化。干预组均以阻断为目的,在孕24-28周开始口服富马酸替诺福韦二吡呋酯片（TDF）300 mg/d,购自葛兰素史克（天津）有限公司（国药准字H20153090）;或替比夫定（LDT）600 mg/d,购自北京诺华制药有限公司（国药准字H20070028）,抗病毒治疗直至分娩。数据采用连续变量以均数±标准差;分类变量以率进行统计分析。第二部分,研究人群为第一部分孕妇[非干预组（NT）259例,干预组（1）91例,对照组100例（C）)]及其所生婴幼儿（450例）,干预组及未干预组孕妇所生新生儿/婴幼儿均采取国家标准乙型肝炎计划免疫主被动联合接种（出生6 h内肌肉注射乙型肝炎免疫球蛋白100U,及0、1、6个月每次肌肉注射基因工程乙型肝炎疫苗10 μg）,对照组只注射乙型肝炎疫苗（0、1、6个月每次肌肉注射基因工程乙型肝炎疫苗10μg）。观察孕周及孕期不良反应,新生儿Apgar评分,及其幼儿7个月龄时定量检测血清乙型肝炎标志物（hepatitis B virus marker,HBVM）及 HBV DNA。HBV 母婴传播感染定义为乙型肝炎孕妇所生小孩出生后在7月龄后检测HBsAg阳性,或伴有HBV DNA阳性。数据统计:两两比较用LSD方法,组间比较,采用t检验,疗效分析采用协方差分析,组内比较采用符号秩和检验。第三部分,研究人群为第一部分孕妇（干预组91例及非干预组259例）及其所生婴幼儿（350例）,HBV孕妇于孕16-24周采血10ml进行二代测序,预测胎儿是否发生宫内感染（由贵州省产前诊断中心完成）,并已收集临床信息与血液样本。在充分考虑感染组与非感染组之间孕妇年龄和怀孕周数等特征分布平衡的基础上,从中挑选出一个包括128对母婴的样本测试集,其中经产后随访证实其中29例（均为第一部分未干预者）发生宫内感染,未发生宫内感染的母婴99对。通过孕妇血样中病毒DNA及胎儿游离DNA的提取和采取Illumina HiSeq 2000平台的测序分析,判断母婴病毒全基因序列同源性及发现有宫内传播优势的特异突变位点。统计学方法:组间比较,采用t检验,组内比较采用符号秩和检验。采用R软件3.2.3版本提供的“randomForest”工具包构建随机森林模型。结果:第一部分,对干预组91例e抗原阳性或和高载量病毒复制乙肝孕妇进行HBV基因分型:B型57例（57/91,62.63.18%）,C型34例（34/91,37.36%）,未发现其他基因类型。干预组用替诺福韦（TDF）和替比夫定（LDT）在人口统计学和临床特征方面没有差异,包括肝功能检查[TDF 治疗前:ALT21.30（9.01-362.49）,AST 25.19（13.62-345.53）,TBIL8.16（3.79-57.55）,ALP78.44（31.00-232.52）,TBA3.70（0.83-45.23）,治疗结束时:ALT 21.30（8.66-98.10）,AST 24.65（14.91-101.92）,TBIL 8.78（3.16-17.11）),ALP 148.05（53.98-470.61）,TBA 3.07（0.92-74.83）];LDT 组治疗前:ALT22.56（6.65-117.00）)AST23.02（16.37-62.00）,TBIL7.81（5.48-18.27）,ALP67.35（46.05-388.21）,TBA3.24（1.06-42.58）,治疗结束时:ALT 21.40（8.14-62.05）,AST 24.10（11.79-160.64）,TBIL 7.28（3.50-18.40）,ALP 162.40（47.30-423.96）,TBA 3.76（0.69-28.41）]。Log10（HBV DNA）和 Log10（HBV RNA）[TDF 组(治疗前:HBVDNA 4.84±2.01,HBVRNA6.35±1.10;治疗 4 周时:HBVDNA3.99±0.79,HBVRNA 6.05±0.94;治疗结束时:HBVDNA 3.06±0.66,HBVRNA 5.52±0.85;LDT 组（治疗前:HBVDNA5.08±1.99,HBVRNA6.47 ± 0.88;治疗 4 周时:HBVDNA4.45±1.18,HBVRNA6.51±0.82;治疗结束时:HBVDNA3.51±1.20,HBVRNA6.13±0.66）],与治疗前（孕12-24周）相比,替诺福韦与替比夫定在治疗结束时,Log10（HBVDNA）和Log10（HBV RNA）显着降低（P<0.05）。在排除其他变量的影响下,HBV基因型对HBVRNA载量有一定的影响,表现在C基因组的患者HBVRNA在治疗结束时比B基因组的患者少下降了 0.54个单位（logl0）,P值（0.01）<0.05。孕期CD3+及CD19细胞在各组中变化不大,而未干预组及干预组在用药前CD4+T细胞及CD8+T细胞较正常孕妇比较,其表达减低统计学有差异（P<0.05）,干预组用药后较用药前CD4+T细胞及CD8+T细胞表达增加,但CD4+T细胞增加更为明显,表达有统计学差异（F=9.38,P<0.01）,干预组用药后较正常对照组有差异,但无统计学意义,NK细胞（CD16+CD56）在未干预组及干预组用药前较对照组下降,有统计学差异（F=8.72 P=0.014）。第二部分HBV母婴结局观察到未干预组婴幼儿有乙型肝炎感染,表现为HBsAg 阳性（29/259,11.19%）,HBeAg 阳性（24/259,9.26%）及 HBV DNA 阳性（27/259,10.24%）。HBV母婴传播感染率为11.19%（29/259）,进一步分析非干预组婴幼儿HBV感染与母亲HBV DNA载量的关系,当母亲HBV DNA ≥ 106 IU/ml,其母婴传播感染高达38.67%（29/75）,本研究中母婴传播感染组其母亲HBV DNA均大于106 IU/ml,其中,HBeAg阳性15例,HBeAg阴性14例,针对二胎HBV孕妇（第一胎被感染HBV）中,未干预组有1例感染HBV。未干预原因主要由于孕妇就诊时间较晚,就诊时为孕38周,孕妇HBV DNA>106 IU/ml,HBeAg阳性。其余未干预组二胎孕妇病毒量均较低,其婴幼儿均未被感染。干预组其婴幼儿检测HBsAg,HBeAg及HBV DNA均阴性,HBV母婴传播感染率为零,HBV母婴阻断率为100%。而且有不同程度的乙型肝炎保护性抗体出现,其抗体滴度高于非干预组及对照组孕妇所生婴幼儿,差异有统计学意义（F=5.95,P<0.001）,与其孕妇既往感染HBV时间,孕周及分娩方式,新生儿出生Apgar评分,出生体重,喂养方式,性别等无统计学差别,但与孕期抗病毒治疗有明显的统计学差异。第三部分,针对29对发生HBV母婴垂直感染母婴患者,通过二代测序技术,成功从孕妇血标本提取胎儿游离DNA和乙肝病毒DNA及其测序,分析乙肝病毒全基因序列显示,各母子对病毒全基因序列同源性在99.4%至100%,19对母子（占比65.5%）病毒序列完全一致。按不同基因型分别与B2和C2野生型乙肝病毒株序列进行比较,母亲感染的B和C基因型突变株与野生株乙肝病毒均可通过宫内传播,未发现有宫内传播优势的特异突变位点。结论:1.贵州地区乙肝孕妇以B,C基因型为主,以阻断治疗为目的,在不同的基因型孕妇使用替诺福韦（TDF）或替比夫定（LDT）阻断治疗时,均能取得较好的疗效,但在持续抗病毒治疗基础上,B基因型病毒更容易得到控制。孕中晚期使用TDF或LDT治疗除可以控制HBV病毒外,未见明显不良反应,还可调节孕妇机体的T淋巴细胞免疫功能,其机制可能与改善CD4+T细胞亚群重建,继而引起CD8+T细胞增多有关。2.本课题非干预组发生了 HBV母婴传播,发生率为11.19%,母婴传播感染者其母亲分娩前HBV DNA均大于≥ 106 IU/ml,其中,HBeAg阳性15例,HBeAg阴性14例。进一步分析非干预组婴幼儿HBV感染与母亲HBV DNA载量的关系,当母亲HBV DNA≥106IU/ml其母婴传播感染高达38.67%（29/75）,提示高载量HBVDNA复制是发生乙型肝炎母婴传播的独立危险因素。3.二代测序技术用于监测HBV基因及其突变,产前无创性诊断HBV宫内传播,为设计精准的及个体化乙肝抗病毒抗病毒方案提供可靠的依据,可能是乙肝母婴传播的产前诊断重要评估技术。因此,针对乙型肝炎高风险孕妇,需产前HBV动态监测及药物干预与产后标准联合免疫阻断,才能从真正临床上实现乙型肝炎母婴零传播。
袁伦志[9]（2019）在《人骨髓间充质干细胞移植建立新型人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型用于乙型肝炎病毒感染诱发肝硬化初步研究》文中研究指明乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染在全球范围内造成了严重的疾病负担。HBV感染具有严格的宿主种属特异性和肝细胞嗜性,其感染人肝细胞后能够持续复制,诱发宿主免疫耐受状态、逐步形成慢性化、直接或间接诱导一系列病理生理学变化并造成重症肝炎、肝衰竭、肝纤维化、肝硬化和肝癌等终末期肝脏疾病。目前,虽然预防性疫苗的普及已经在很大程度上控制HBV新发感染率,但是已批准上市的临床药物仍然无法彻底清除病毒,实现功能性治愈。由于HBV的天然宿主人类和猩猩等大型灵长类动物用于研究收到严格的伦理限制,因此发展能够最大限度模拟HBV感染和发病的动物模型成为进一步认识HBV感染发病机制,以及研发和评价新一代抗HBV药物所面临的一项挑战。数十年来,研究人员建立了转基因小鼠、尾静脉高压注射小鼠、旱獭、北京鸭和树鼩等替代模型,然而它们都不能完全模拟HBV在人类中感染发病的自然史,因此,建立人源化小鼠动物模型,特别是人肝和人免疫系统双嵌合的人源化小鼠动物模型,用于支持HBV感染发病相关研究具有相当的重要性。然而,目前已有的人源化小鼠动物模型一直存在原代人细胞来源匮乏和体外难以扩增、个体差异大、多种细胞移植不匹配、伦理问题、造模周期长、实验窗口期短和难以模拟HBV感染相关的终末期肝脏疾病等限制。因此,建立一种方便易用的、能够支持HBV感染发病研究的新型人源化小鼠动物模型对于进一步推进HBV相关基础研究和治疗策略的发展十分必要。本论文中,我们利用临床分离的健康人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs）在免疫缺陷小鼠体内同时重建了同源的人源肝脏和免疫系统,并将此种双嵌合人源化小鼠用于乙肝病毒感染及相关病理生理学研究。我们对乙肝病毒的生物学特征、流行病学、感染自然史、相关肝脏疾病、天然宿主动物、感染细胞和动物模型等方面进行综述研究,基于前期研究和对最新研究成果的考察,我们发现hBMSCs具有重建人类肝脏和免疫系统的巨大的潜力,并选择其作为我们构建新型双嵌合人源化小鼠模型的细胞材料。我们使用hBMSCs移植暴发性肝衰竭免疫缺陷FRGS小鼠,发现其能够在小鼠体内迅速转分化为具有活性的人肝细胞和多种人免疫细胞,同时证明暴发性肝衰竭的肝脏微环境是驱动hBMSCs在免疫缺陷FRGS小鼠体内大量快速转分化为人源肝细胞和免疫细胞的重要驱动因素。我们在hBMSCs移植的免疫缺陷FRGS小鼠（hBMSC-FRGS）体内建立了HBV慢性感染,实现A,B,C,D四种常见HBV基因型病毒感染超过50周。我们连续监测了 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠血清和肝内病毒DNA及蛋白水平,证明被HBV感染的小鼠血清内含有具备感染活力的HBV病毒颗粒。我们初步研究了HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠体内的免疫病理生理学变化,在感染进行和持续和过程中同步分析了小鼠肝内人源免疫细胞、人源细胞因子、肝脏炎症进展和HBV特异性人源抗体水平等指标,证明HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠出现持续的肝脏炎症和免疫耐受状态。我们在HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠体内观察到一系列的指示肝硬化发生发展的典型性指标,包括:肝硬化血清学指标持续增高、小鼠肝脏组织中肝硬化相关人源基因表达持续上调、小鼠肝脏组织中胶原纤维堆积持续增加、纤维结节生成、肝小叶结构被破环、肝板塌陷、肝脏外表粗糙体积固缩等。综上所述,我们建立了肝脏和免疫系统双重人源化的hBMSC-FRGS小鼠模型,将其用于HBV感染和相关免疫病理生理学研究,并通过长期观察发现HBV感染后小鼠产生肝脏炎症并且逐步发展为典型的肝硬化。
李雪婷[10]（2019）在《HBeAg/Anti-HBe双阳性慢性HBV感染者的临床及分子病毒学特征分析》文中研究表明【目的】分析双阳性（HBeAg+/Anti-HBe+）慢性HBV感染者的临床特征,并检测双阳性感染者血清中HBV核心启动子（Core Promoter,CP）区、前C区（Pre C region,Pre C）、C区基因突变情况,阐明双阳性的分子病毒学特征,为慢性乙型肝炎的诊疗提供理论和实验依据。【方法】1.分析HBeAg/Anti-HBe双阳性慢性HBV感染者的临床特征收集2017年4月至2018年4月就诊于福建医科大学附属第一医院共11,154例慢性HBV感染者信息,其中302例双阳性感染者作为GROUPⅠ,随机抽取905例HBeAg阳性且Anti-HBe阴性（HBeAg+/Anti-HBe-）感染者作为GROUPⅡ,随机抽取1405例HBeAg阴性且Anti-HBe阳性（HBeAg-/Anti-HBe+）感染者作为GROUPⅢ,收集所有患者的HBsAg、HBeAg、Anti-HBe、HBV DNA、肝功能、甲胎蛋白、临床诊断等资料信息。采用Oneway ANOVA、F检验、Kruskal-Wallis H检验、Mann-Whitney U检验、χ2检验和Fisher确切概率法对三组感染者年龄、性别、HBV DNA等临床特征进行组间差异性分析。2.HBeAg/Anti-HBe双阳性慢性HBV感染者的分子病毒学特征收集2017年4月至2018年4月共60例HBV DNA>500 IU/ml的HBeAg+/Anti-HBe+慢性HBV感染者血清为实验组,随机收集相同时期HBV DNA>500 IU/ml的75例HBeAg+/Anti-HBe-慢性HBV感染者血清作为对照组I,随机收集相同时期HBV DNA>500 IU/ml的104例HBeAg-/Anti-HBe+慢性HBV感染者血清作为对照组II。将血清进行HBV DNA抽提,巢氏PCR扩增HBV CP、Pre C、C区基因并测序。采用t检验、Oneway ANOVA检验、F检验、Kruskal-Wallis H检验、Mann-Whitney U检验、Fisher确切概率法及Pearson相关性分析对三组感染者CP区核苷酸突变率及Pre C、C区氨基酸突变率进行统计分析,以明确双阳性感染者HBV的分子病毒学特征。【结果】1.HBeAg/Anti-HBe双阳性慢性HBV感染者的临床特征慢性HBV感染者中双阳性感染者占2.71%,双阳性感染者年龄分布呈现先增高后减低的趋势,在3140岁阶段达到峰值（26.49%）,男性多于女性（70.00%VS 30.00%）。双阳性感染者HBsAg≥250 IU/ml比例介于HBeAg+/Anti-HBe-和HBeAg-/Anti-HBe+感染者之间（88%VS 92%VS 55%,P<0.001）。双阳性感染者HBeAg滴度[2.99（1.5-6.5）S/CO]较HBeAg+/Anti-HBe-感染者[78.47（6.02-1287.82）S/CO]低（P<0.001）。双阳性感染者Anti-HBe滴度[0.67（0.34-0.93）S/CO]较HBeAg-/Anti-HBe+感染者[0.01（0.01-0.02）S/CO]低（P<0.001）。HBV DNA>500 IU/ml的比例:GROUP II>GROUP I>GROUP III（43%VS 29%VS 23%,P<0.0001）。GROUPⅠ中肝硬化的患者比例较GROUPⅡ高（14.2%VS 10.4%,P<0.01）与GROUPⅢ无显着差异。GROUP I中肝恶性肿瘤的患者比例较GROUPⅡ高（13.9%VS 3.9%,P<0.01）,与GROUPⅢ无显着差异。GROUPⅠALT>80 U/L的感染者比例较GROUPⅢ高（20%VS 8%,P<0.0001）。2.HBeAg/Anti-HBe双阳性慢性HBV感染者的分子病毒学特征三组感染者间基因型分布存在显着差异（P<0.0001）:实验组B/C基因型分布（50.59%VS 49.12%）与对照组ⅠB/C基因型（50.85%VS 49.15%）分布较一致,对照组II以B基因型占优势（82.81%VS 17.18%）。通过CP区核苷酸序列分析发现:实验组较对照组I在CP区有更高的突变率（1.58%VS 1.12%,P<0.05）。实验组在nt1753、nt1762/1764等与肝脏疾病进展相关的位点出现突变的比例显着高于对照组Ⅰ（nt1753:20%VS 4%,nt1762/1764:47%VS 18%,均P<0.05）,累计突变率亦高于对照组Ⅰ、对照组Ⅱ（0.24±0.2 VS 0.12±0.14 VS 0.17±0.17,P<0.05）。随着基础核心启动子（Basic Core Promoter,BCP）区累计突变核苷酸个数增加,HBeAg有降低趋势（r=-0.474,P<0.05）。对Pre C区序列分析发现:仅对照组Ⅱ较实验组在ntG1896A的突变比例更高（P<0.05）,其余突变位点均未见统计学差异。对C区序列进行分析发现:实验组氨基酸突变位置多位于与HLA-I或HLA-II相关的抗原肽中。对照组II的C区氨基酸突变较实验组及对照组I明增多（5.42±3.82 VS 2.36±1.70 VS 1.91±1.87,P<0.0001）。【结论】1.HBeAg/Anti-HBe双阳性与患者的肝脏损害和肝脏疾病进展相关。2.HBeAg/Anti-HBe双阳性感染者BCP区存在较多与疾病进展相关的突变位点。3.BCP区核苷酸累计突变与HBeAg滴度呈负相关,较高的BCP区累计突变可能是导致HBeAg/Anti-HBe双阳性形成的原因之一。4.HBeAg/Anti-HBe双阳性感染者C区突变较HBeAg-/Anti-HBe+感染者少。
二、肝癌及肝硬化患者血清HBV X基因检测及序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肝癌及肝硬化患者血清HBV X基因检测及序列分析（论文提纲范文）
（1）PCR产物直接测序检测HBV逆转录酶区耐药突变方法的建立及临床应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分:乙型肝炎病毒逆转录酶区耐药突变检测方法的建立与评价 |
| 引言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要试剂配制 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 PCR检测HBV耐药突变方法的建立 |
| 2.1.1 引物的合成 |
| 2.1.2 HBV DNA阳性患者血清中模板的提取 |
| 2.1.3 PCR扩增HBV RT基因 |
| 2.1.4 PCR产物检测 |
| 2.1.5 PCR产物测序分析和基因型鉴定 |
| 2.2 重组质粒标准模板的构建 |
| 2.2.1 引物合成 |
| 2.2.2 基因片段的PCR扩增 |
| 2.2.3 PCR产物纯化 |
| 2.2.4 PCR产物和质粒载体的限制性内切酶消化 |
| 2.2.5 酶切消化物的连接 |
| 2.2.6 感受态细胞的制备 |
| 2.2.7 连接产物的转化 |
| 2.2.8 菌落PCR鉴定 |
| 2.2.9 阳性转化子质粒DNA的提取和检测 |
| 2.2.10 重组质粒DNA的测序鉴定 |
| 2.3 PCR产物直接测序检测HBV耐药突变方法的评价 |
| 2.3.1 重组质粒的大量提取及浓度检测 |
| 2.3.2 PCR产物直接测序法的检测限分析 |
| 2.3.3 PCR产物直接测序法对耐药突变株检测的重复性 |
| 2.3.4 PCR产物直接测序法的对耐药突变株检测的灵敏度 |
| 2.3.5 PCR产物直接测序法的特异性分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 PCR检测HBV耐药突变方法的建立 |
| 3.1.1 PCR扩增目的基因 |
| 3.1.2 PCR产物测序分析和基因型鉴定 |
| 3.2 重组质粒标准模板的构建 |
| 3.2.1 PCR扩增目的基因 |
| 3.2.2 目的基因和质粒DNA酶切产物鉴定 |
| 3.2.3 连接产物的转化分析 |
| 3.2.4 菌落PCR鉴定 |
| 3.2.5 阳性转化子质粒DNA的鉴定 |
| 3.2.6 阳性克隆测序分析 |
| 3.3 PCR产物直接测序检测HBV耐药突变方法的评价 |
| 3.3.1 PCR产物直接测序法的检测限分析 |
| 3.3.2 PCR产物直接测序法对耐药突变株检测的重复性 |
| 3.3.3 PCR产物直接测序法对耐药突变株检测的灵敏度 |
| 3.3.4 PCR产物直接测序法的特异性分析 |
| 4 小结 |
| 第二部分:PCR产物直接测序法检测HBV耐药变异的临床应用 |
| 引言 |
| 1 资料与方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 仪器与材料 |
| 1.2.1 实验主要试剂 |
| 1.2.2 主要仪器设备 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 患者血清免疫标志物和肝功能指标的检测 |
| 1.3.2 HBV DNA定量检测 |
| 1.3.3 HBV DNA的提取 |
| 1.3.4 HBV逆转录酶区基因扩增 |
| 1.3.5 测序分析 |
| 1.3.6 HBV基因型分析 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR扩增目的基因 |
| 2.2 PCR产物测序分析 |
| 2.3 HBV基因型分析 |
| 2.4 临床资料比较 |
| 2.5 HBV逆转录酶区基因耐药突变分析 |
| 2.6 HBV耐药突变模式分析 |
| 2.7 HBV RT区非经典耐药位点突变分析 |
| 3 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录1 综述:慢性HBV感染者逆转录酶基因突变检测的临床意义 |
| 参考文献 |
| 附录2 攻读硕士学位期间的科研论文及学术交流获奖情况 |
| 致谢 |
（2）血清HBV RNA在慢性HBV感染者病情评估和耐药监测中的应用（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 微滴数字PCR用于血清HBVRNA定量方法的建立及与实时荧光定量PCR方法的对比评价 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 血清HBV RNA在未治慢性HBV感染者中的分布特点及其临床意义 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 恩替卡韦耐药及部分病毒学应答患者血清HBV RNA动力学特征以及用于长期监测耐药突变的初步研究 |
| 4.1 研究对象和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 全文总结与研究展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 慢性乙型肝炎血清学标志物研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（3）青藏高原藏族人群乙型肝炎病毒全基因组突变分析及时空动力学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语表 |
| 前言 |
| 第一部分 青藏高原藏族人群HBV基因序列分析 |
| 一、材料与方法 |
| 1.样本来源 |
| 2.引物及扩增条件 |
| 3.主要试剂、耗材及生产厂家 |
| 4.主要仪器设备及生产厂家 |
| 5.HBV生物信息学分析主要软件 |
| 6.实验方法 |
| 7.HBV荧光定量PCR检测 |
| 8.生物信息学分析方法 |
| 9.统计分析 |
| 10.质量控制 |
| 二、结果 |
| 1.青藏高原藏族人群血清HBV全序列扩增结果 |
| 2.HBV DNA全长序列分型分析 |
| 3.青藏地区HBV/CD重组体不同区段系统发育分析结果 |
| 4.青藏高原藏族人群全长序列基本信息及地理分布 |
| 5.HBV/CD重组体全序列基因变异分析结果 |
| 6.HBV血清型分析结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第二部分 HBV/CD重组型表面抗原抗体双阳性研究 |
| 一、材料与方法 |
| 1.样本来源 |
| 2.DNA序列拼接与分析 |
| 3.HBV荧光定量PCR检测 |
| 4.统计分析 |
| 二、结果 |
| 1.HBsAg和HBsAb双阳性的发生率 |
| 2.双阳性组和对照组的基本信息 |
| 3.PreS/S区氨基酸突变率分析结果 |
| 4.全序列核苷酸和氨基酸突变位点分析结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第三部分 HBV/CD重组体时空动力学分析 |
| 一、材料与方法 |
| 1.HBV全长基因序列数据库构建 |
| 2.数据库内序列的基因型和重组分析 |
| 3.用于时空动态分析的主要工具和软件 |
| 4.时空动态分析方法 |
| 5.统计分析 |
| 二、结果 |
| 1.HBV全长基因序列数据库构建情况 |
| 2.HBV D基因片段tMRCA分析结果 |
| 3.HBVC基因片段tMRCA分析结果 |
| 4.HBV/CD1重组体tMRCA及种群动态分析结果 |
| 5.HBV/CD2重组体tMRCA及种群动态分析结果 |
| 6.HBVC基因型和D基因型时空动态分析结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 全文小结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 乙肝病毒感染者血清表面抗原表面HBsAg/HBsAb双阳性研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（4）云南地区少数民族中HBV的流行和HBV pgRNA检测方法的建立与评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 乙型肝炎 |
| 1.2 HBV传播方式 |
| 1.3 HBV的基因组和生命周期 |
| 1.3.1 HBV的复制与转录 |
| 1.4 HBV基因分型与重组变异 |
| 1.5 HBV基因型地理分布情况 |
| 1.5.1 HBV基因型在世界的流行 |
| 1.5.2 HBV基因型在中国的流行 |
| 1.5.3 HBV基因型在云南的流行 |
| 1.6 国内外不同种族/民族基因型流行现状 |
| 1.6.1 全球不同种族乙型肝炎流行现状 |
| 1.6.2 中国不同民族乙型肝炎流行现状 |
| 1.6.3 HBV在云南各少数民族的流行 |
| 1.7 乙型病毒性肝炎的治疗 |
| 1.7.1 乙型肝炎的治疗现状 |
| 1.7.2 乙肝治疗的新型血清标志物HBV PgRNA |
| 1.8 研究的目的和意义 |
| 1.9 研究的技术路线 |
| 第二章 云南地区HBV在少数民族中的流行 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 主要的仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 乙肝表面抗原(HBs Ag)ELISA检测 |
| 2.3.2 病毒DNA核酸提取 |
| 2.3.3 引物设计与样本巢式PCR扩增 |
| 2.3.4 琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 2.3.5 琼脂糖凝胶DNA回收 |
| 2.3.6 送测序 |
| 2.3.7 双峰样品TA克隆 |
| 2.3.8 菌落PCR |
| 2.3.9 数据分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 云南省HBV的流行病学 |
| 2.4.2 部分受试样本乙型肝炎表面抗原检测阳性结果 |
| 2.4.3 受试者临床生化分析 |
| 2.4.4 HBV部分基因组序列扩增结果及测序分析 |
| 2.4.5 HBV部分基因组序列的系统发育分析 |
| 2.4.6 云南省HBV基因型在少数民族中的流行分布情况 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 HBV基因分型 |
| 2.5.2 HBV在云南地区少数民族中的分布 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 HBV基因组全长扩增 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验对象 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 引物设计 |
| 3.3.2 巢式PCR扩增 |
| 3.3.3 测序 |
| 3.3.4 数据分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 HBV基因组序列全长扩增结果及测序分析 |
| 3.4.2 基于全长HBV基因组序列的重组分析 |
| 3.4.3 毒株YNKM91 的全长HBV基因组序列的系统发育和重组分析 |
| 3.4.4 HBV B/I重组毒株(YNKM91)的子区域进化树 |
| 3.4.5 HBV基因型重组序列的重组片段和断点位置分析 |
| 3.4.6 新型HBV亚型C17的全长基因组序列分析 |
| 3.4.7 新型HBV亚型C17的全长基因组耐药突变分析 |
| 3.4.8 HBV新亚型B10全长基因组序列分析 |
| 3.4.9 新型HBV亚型B10的全长基因组耐药突变分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 HBV新亚型的鉴定与命名 |
| 3.5.2 HBV重组分析 |
| 3.5.3 HBV耐药突变分析 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 HBV PgRNA定量检测方法的建立及应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验对象 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 主要实验仪器 |
| 4.2.4 主要的数据分析方法 |
| 4.3 引物设计 |
| 4.3.1 普通PCR引物设计 |
| 4.3.2 荧光定量PCR引物和探针的设计 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.4.1 样品准备 |
| 4.4.2 样品RNA提取 |
| 4.4.3 PCR扩增HBV PgRNA目的片段 |
| 4.4.4 PCR电泳检测 |
| 4.4.5 目的片段和质粒载体片段双酶切 |
| 4.4.6 PCR产物及质粒载体的纯化 |
| 4.4.7 送测序 |
| 4.4.8 PET32a-PgRNA质粒的构建 |
| 4.5 阳性重组质粒的提取 |
| 4.6 质粒酶切验证和测序验证 |
| 4.6.1 重组阳性质粒双酶切验证 |
| 4.7 HBV PGRNA产物体外转录及纯化 |
| 4.7.1 HBV PgRNA产物体外转录 |
| 4.7.2 HBV PgRNA体外转录产物的纯化 |
| 4.8 荧光定量PCR反应条件的建立 |
| 4.9 荧光定量PCR的反应体系和反应条件 |
| 4.10 结果 |
| 4.10.1 阳性质控品的构建 |
| 4.10.2 Taq_Man的灵敏性实验 |
| 4.10.3 Taq_Man的重复性实验 |
| 4.10.4 Taq_Man的特异性实验 |
| 4.10.5 两种HBV pgRNA检测方法的评价 |
| 4.10.6 临床样本的检测 |
| 4.11 讨论 |
| 4.11.1 Taq Man探针法的灵敏性、特异性和重复性的评价 |
| 4.11.2 临床样本的检测结果评价 |
| 4.12 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读硕士期间发表论文目录 |
（5）使用结构生物信息学方法研究HBV突变在肝癌免疫逃逸中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 Hepatitis b virus病毒的特征 |
| 1.1.1 HBV病毒的基因结构 |
| 1.1.2 HBV病毒入侵机制 |
| 1.1.3 不同种族人群中HBV基因型的感染偏好 |
| 1.2 MHC分子的特征 |
| 1.2.1 MHC分子相关抗原肽的加工过程 |
| 1.2.2 经典的HLA复合体结构 |
| 1.2.3 MHC分子、抗原肽和TCR间的相互作用 |
| 1.2.4 HLA在临床医学应用及疾病中的研究进展 |
| 1.3 HBV病毒突变的研究进展 |
| 1.3.1 HBV病毒自发突变及HBV DNA插入宿主肝细胞基因组 |
| 1.3.2 HBV相关肝癌的用药及其耐药机制的相关研究 |
| 1.3.3 HBV的重激活 |
| 1.3.4 HBV相关的免疫逃逸 |
| 1.4 展望 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 数据收集 |
| 2.1.1 HBV病毒基因组序列收集 |
| 2.1.2 HLA亚型及其结构的收集 |
| 2.2 HBV突变抗原肽的预测 |
| 2.2.1 不同基因型HBV参考序列的确定,保守性及理化性质的分析 |
| 2.2.2 HBV突变位点的确定及抗原肽预测 |
| 2.3 模拟HBV抗原肽与MHC I类分子的对接 |
| 2.3.1 蛋白质准备 |
| 2.3.2 分子对接 |
| 2.4 扫描氨基酸突变计算 |
| 2.5 分子动力学模拟 |
| 2.5.1 分子动力学模拟参数设置 |
| 2.5.2 RMSD分析 |
| 2.6 结合自由能计算 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 中国和欧美人群中HBV突变位点的特征 |
| 3.2 预测的21 个候选突变 |
| 3.3 HLA分子与抗原肽对接结构的特征 |
| 3.4 影响p-MHC复合体形成的13 个关键突变 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 主要科研成果 |
（6）慢性乙肝病毒感染者核苷（酸）类似物长期抗病毒治疗疗效与乙肝病毒准种异质性及进化机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 核苷(酸)类似物长期抗病毒治疗疗效分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 HBV RT区准种进化模式与核苷类药物抗病毒治疗应答关系的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 HBsAg和抗-HBs共存乙肝病毒基因型Ⅰ感染者HBV准种特征及相关文献回顾Meta分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 综述 慢性乙型肝炎患者病毒准种的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（7）单独或联合HBsAg与HBV-DNA指标对原发性肝癌发病风险的预测作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 研究对象与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.1.1 研究设计 |
| 2.1.2 研究对象 |
| 2.1.3 研究对象纳入标准与排除标准 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 研究方法 |
| 2.2.2 统计方法 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 基本资料 |
| 3.2 单因素Logistic回归分析 |
| 3.2.1 吸烟与饮酒 |
| 3.2.2 2型糖尿病 |
| 3.2.3 肝癌家族史 |
| 3.2.4 HBeAg阳性 |
| 3.2.5 HBsAg和 HBV-DNA |
| 3.3 多因素Logistic回归分析 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 进一步工作的方向 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（8）贵州地区高风险乙型肝炎孕妇母婴垂直传播阻断的真实世界回顾性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 替诺福韦及替比夫定对贵州地区高风险乙肝孕妇孕期HBV病毒及免疫功能影响 |
| 前言 |
| 1. 对象与方法 |
| 1.1 研究人群 |
| 1.2 治疗方案 |
| 1.3 资料收集 |
| 1.4 检测方法 |
| 1.5 统计学方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 孕妇基本资料 |
| 2.2 干预组用TDF或LDT前肝功能及乙肝标志物及HBVDNA及HBVRNA,基因型对比 |
| 2.3 自孕24-28周用替诺福韦或者替比夫定抗病毒治疗效果判断 |
| 2.4 不同基因型的HBVDNA在不同治疗时间点的变化趋势 |
| 2.5 不同基因型的HBVRNA在不同治疗时间点的变化趋势 |
| 2.6 孕期免疫功能变化 |
| 3. 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 对贵州地区高风险乙型肝炎孕妇母婴传播的临床结局观察 |
| 前言 |
| 1 对象及方法 |
| 1.1 研究人群 |
| 1.2 阻断措施 |
| 1.3 资料收集 |
| 1.4 诊断标准 |
| 1.5 检测方法 |
| 1.6 统计学方法 |
| 结果 |
| 2.1 分娩前干预组及非干预组HBV孕妇基本资料产后新生儿情况 |
| 2.2 未干预组与干预组所分娩的婴幼儿HBV母婴传播感染比较 |
| 2.3 未干预组与干预组,对照组所分娩的婴幼儿畸形率及产生乙肝保护性抗体(HBsAb)比较 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 探索乙肝病毒宫内感染的无创性产前诊断 |
| 前言 |
| 1. 对象及方法 |
| 1.1 研究人群 |
| 1.2 检测方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 胎儿游离DNA和乙肝病毒DNA的提取 |
| 2.2 胎儿游离DNA和乙肝病毒DNA测序 |
| 2.3 乙肝母婴传播产前预测模型 |
| 2.4 母婴垂直传播的HBV基因型及基因序列测定及其同源性判断 |
| 3. 讨论 |
| 小结 |
| 总结及展望 |
| 1. 本研究取得的成果 |
| 2. 本研究的创新之处 |
| 3. 本研究存在的不足 |
| 4. 展望 |
| 参考文献 |
| 综述乙肝病毒基因型及宿主基因多态性 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间本人出版或公开发表的论着、论文 |
| 博士在读期间主持课题 |
| 博士在读期间所获科研奖励 |
| 英文缩略语 |
| 致谢 |
（9）人骨髓间充质干细胞移植建立新型人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型用于乙型肝炎病毒感染诱发肝硬化初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1. 乙型肝炎病毒 |
| 1.1 HBV的起源与进化 |
| 1.2 HBV的病毒结构 |
| 1.3 HBV的基因组结构及其编码蛋白 |
| 1.4 HBV的感染机制和生命周期 |
| 2. 乙型肝炎病毒感染及其造成的相关肝脏疾病 |
| 2.1 HBV感染的主要宿主 |
| 2.2 HBV的全球流行状况 |
| 2.3 HBV感染的自然历史过程 |
| 2.4 HBV感染慢性化诱发的相关肝脏疾病 |
| 2.5 HBV感染的诊断和治疗 |
| 3. 乙型肝炎病毒感染细胞模型 |
| 3.1 基于人肝癌细胞系的HBV稳定复制细胞系 |
| 3.2 基于原代人肝细胞和原代树鼩肝细胞的HBV感染细胞模型 |
| 3.3 基于人肝脏祖细胞系HepaRG的HBV感染细胞模型 |
| 3.4 基于受体过表达的人肝癌细胞系的HBV感染细胞模型 |
| 3.5 基于受体过表达的原代猪肝细胞和原代猴肝细胞的HBV感染细胞模型 |
| 3.6 基于人干细胞分化获得类肝细胞的HBV感染细胞模型 |
| 4. 乙型肝炎病毒感染动物模型 |
| 4.1 灵长类HBV感染模型 |
| 4.2 树鼩HBV感染模型 |
| 4.3 土拨鼠替代模型 |
| 4.4 北京鸭替代模型 |
| 4.5 HBV转基因小鼠 |
| 4.6 基于病毒基因组转染的HBV复制小鼠模型 |
| 4.7 人类肝脏单嵌合小鼠模型支持HBV感染及抗病毒研究 |
| 4.7.1 免疫缺陷小鼠和细胞移植 |
| 4.7.2 uPA缺陷的免疫缺陷小鼠模型 |
| 4.7.3 HSV-tk/NOG小鼠模型 |
| 4.7.4 Fa~(-/-)Rag2~(-/-)IL2rg~(-/-)(FRG)小鼠模型 |
| 4.7.5 FRGS小鼠模型 |
| 4.8 人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型支持HBV相关疾病研究 |
| 4.8.1 AFC8-hu HSC/Hep小鼠模型 |
| 4.8.2 人肝和人免疫系统双嵌合的FRGN和uPA-NOG小鼠 |
| 4.8.3 A2/NSG-hu HSC/Hep小鼠 |
| 4.8.4 HIS-Hep-FRGN小鼠 |
| 4.8.5 HIS-HUHEP-uPA/NRG小鼠 |
| 5. 人骨髓间充质干细胞的生物学特性 |
| 5.1 人骨髓间充质干细胞的发现 |
| 5.2 人骨髓间充质干细胞的分离纯化和体外培养 |
| 5.3 人骨髓间充质干细胞的多向分化分化潜能和免疫调节功能 |
| 5.4 人骨髓间充质干细胞移植治疗暴发性肝衰竭的分子机制 |
| 6. 本研究的目的、意义和思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 7. 研究中用到的主要仪器、耗材和试剂 |
| 7.1 主要仪器 |
| 7.2 常规耗材 |
| 7.3 生物化学与细胞生物学常规基础试剂 |
| 7.4 定性和定量检测试剂盒 |
| 7.5 实验用主要溶液及培养基配制 |
| 7.6 常规PCR引物 |
| 7.7 常规抗体和荧光素 |
| 7.8 实验动物和细胞 |
| 8. 常规分子生物学及细胞生物学实验方法 |
| 8.1 ELISA/CLEIA检测 |
| 8.2 Western Blot检测 |
| 8.3 细胞免疫荧光实验 |
| 8.4 免疫组化和病理学染色实验 |
| 8.5 常规流式细胞技术 |
| 8.6 常规哺乳动物细胞培养方法 |
| 9. hBMSC-FRGS小鼠模型构建和鉴定 |
| 9.1 hBMSCs分离、传代培养、冻存、复苏和鉴定 |
| 9.2 FHF-FRGS小鼠的构建及hBMSCs移植手术 |
| 9.3 肝脏灌流分离肝内实质细胞和非实质细胞 |
| 9.4 分离鉴定人源细胞及检测相关标志物 |
| 9.5 鉴定人源肝细胞和鼠源肝细胞是否发生融合 |
| 10. HBV感染相关病毒学和病理学检测 |
| 10.1 不同基因型HBV病毒生产与纯化 |
| 10.2 HBV蛋白与核酸检测方法 |
| 10.3 hBMSC-FRGS小鼠人源免疫反应分析 |
| 10.4 肝硬化诊断方法 |
| 11. 数据处理与统计分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分 hBMSCs移植暴发性肝衰竭FRGS小鼠 |
| 12.1 hBMSCs表型鉴定 |
| 12.2 hBMSCs移植拯救FHF-FRGS小鼠免于死亡 |
| 12.3 hBMSC-FRGS小鼠实现人源肝细胞嵌合 |
| 12.4 hBMSC-FRGS小鼠实现多种人源免疫细胞嵌合 |
| 12.6 嵌合肝脏内的人源肝和鼠源肝细胞未发生融合 |
| 12.7 hBMSC-FRGS小鼠长期安全性评估 |
| 12.8 FHF肝脏微环境是hBMSCs转分化的关键驱动因素 |
| 12.9 第一部分小结 |
| 第二部分 hBMSC-FRGS小鼠支持慢性化HBV感染 |
| 13.1 hBMSC-FRGS小鼠支持多种基因型HBV感染 |
| 13.2 hBMSC-FRGS小鼠支持C基因型HBV感染慢性化 |
| 13.3 第二部分小结 |
| 第三部分 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠免疫病理生理学研究 |
| 14.1 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠肝人源内免疫细胞变化 |
| 14.2 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠血清和肝内人源细胞因子变化 |
| 14.3 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠发生重症肝炎 |
| 14.4 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠产生特异性针对HBV抗原的T细胞 |
| 14.5 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠血清HBV特异性抗体水平变化 |
| 14.6 第三部分小结 |
| 第四部分 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠诱发人源肝硬化 |
| 15.1 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠血清学肝硬化指标变化 |
| 15.2 HBV感染肝hBMSC-FRGS小鼠组织学肝硬化指标变化 |
| 15.3 肝硬化区域种属特异性鉴定 |
| 15.4 第四部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 16. HBV细胞模型和动物模型的发展历程 |
| 17. 基于间充质干细胞的人类肝脏再生和免疫系统重建 |
| 18. HBV感染慢性化和诱导肝脏疾病发生的关键机制 |
| 19. 新型HBV抗病毒治疗策略与关肝脏疾病的防治措施 |
| 第五章 结论和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在校期间科研成果 |
（10）HBeAg/Anti-HBe双阳性慢性HBV感染者的临床及分子病毒学特征分析（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 (Abbreviations) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究背景 |
| 本课题设想 |
| 第一部分 HBeAg/Anti-HBe双阳性慢性HBV感染者的临床特征 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 HBeAg/Anti-HBe双阳性慢性HBV感染者的分子病毒学特征 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、肝癌及肝硬化患者血清HBV X基因检测及序列分析（论文参考文献）
- [1]PCR产物直接测序检测HBV逆转录酶区耐药突变方法的建立及临床应用[D]. 王松姣. 湖北中医药大学, 2021(10)
- [2]血清HBV RNA在慢性HBV感染者病情评估和耐药监测中的应用[D]. 李茂仕. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [3]青藏高原藏族人群乙型肝炎病毒全基因组突变分析及时空动力学研究[D]. 刘贺. 中国疾病预防控制中心, 2020(02)
- [4]云南地区少数民族中HBV的流行和HBV pgRNA检测方法的建立与评价[D]. 刘莹. 昆明理工大学, 2020(05)
- [5]使用结构生物信息学方法研究HBV突变在肝癌免疫逃逸中的作用[D]. 顾霜霖. 东南大学, 2020(01)
- [6]慢性乙肝病毒感染者核苷（酸）类似物长期抗病毒治疗疗效与乙肝病毒准种异质性及进化机制研究[D]. 范晶华. 昆明医科大学, 2019(02)
- [7]单独或联合HBsAg与HBV-DNA指标对原发性肝癌发病风险的预测作用[D]. 杨咪. 南昌大学, 2019(01)
- [8]贵州地区高风险乙型肝炎孕妇母婴垂直传播阻断的真实世界回顾性研究[D]. 张宝芳. 苏州大学, 2019(04)
- [9]人骨髓间充质干细胞移植建立新型人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型用于乙型肝炎病毒感染诱发肝硬化初步研究[D]. 袁伦志. 厦门大学, 2019(08)
- [10]HBeAg/Anti-HBe双阳性慢性HBV感染者的临床及分子病毒学特征分析[D]. 李雪婷. 福建医科大学, 2019(07)