一、β_1整合素及纤维粘连蛋白与肺癌细胞凋亡关系的实验研究（论文文献综述）
宋子琪[1]（2021）在《针刀干预对颈椎间盘退变兔整合素α5、β1和Fn影响的实验研究》文中研究说明研究目的:本实验通过观察颈椎间盘退变兔颈部肌肉形态学改变、椎间盘髓核中整合素α5、β1、纤维粘连蛋白（Fn）以及血液中白介素6（IL-6）含量变化,明确力学改变在椎间盘退变过程中发挥的作用机制,为针刀临床治疗以颈椎病为主的颈椎间盘退变疾病提供实验支持。研究方法:将24只新西兰家兔按随机数字表法分为空白组、模型组、针刀组,每组8只,空白组、模型组与针刀组采用相同固定方式固定。采用“低头位加风寒湿刺激”法建立异常应力诱导下的兔颈椎间盘退变模型,通过颈椎核磁共振（MRI）影像学验证造模是否成功。针刀组在造模结束一周后进行干预,干预在无菌状态下以针刀治疗四步曲为参考,每周一次,共治疗4周。结束后采用HE染色法观察各组实验兔颈部肌肉组织形态学变化;Western Blot法和Real-time PCR法检测椎间盘髓核中整合素α5、β1及Fn含量的变化;Elisa法检测血液中IL-6的含量改变。研究结果:1.一般情况观察:空白组新西兰兔精神可,食欲正常,粪便为质地略硬的黑褐色球状,体重无明显变化,颈部触诊下肌肉松软,无硬结或条索出现,抓取时无明显抵抗;与空白组相比,模型兔可见偶有食欲不振,喜蜷缩于笼子后方,偶有咬笼,部分可出现打喷嚏、头颈向一侧偏歪但可自主恢复,排便有时大小不一或略不成形,甚至出现糊状粪便,造模前后挣扎幅度较大,可有伤人行为,颈部活动不利,触诊下颈肌僵硬,有条索状形成;针刀组实验兔精神正常,治疗时配合良好,无剧烈挣扎,与模型组相比,食欲良好,体重略上升,触诊可见肌肉软硬度有所改善。2.颈椎MRI结果显示:空白组矢状面可见髓核呈高亮信号状态、椎间盘高度正常,横断面可见髓核内信号均匀且与纤维环边界清晰;与空白组相比,模型组椎间盘的高度出现轻度降低,矢状面可见部分椎间盘髓核颜色较暗,呈灰色,信号强度较空白组明显减低,与空白组椎间盘横断面所见的髓核均匀分布相比,模型组髓核内部结构明显分布不均,且纤维环和髓核之间界限模糊,难以分清。3.HE染色显示:空白组可见肌纤维结构清晰,呈长条状平行排列,肌核少量散在纤维附近,肌细胞无变形水肿;与空白组相比,模型组肌纤维出现粗细不皱缩、变形,肌核聚集在附近,肌节不清晰,炎性浸润片状散在出现;与模型组相比,针刀组可见肌纤维挛缩改善,肌核规律分布,炎性细胞浸润明显减少。4.Western Blot法结果显示:与空白组相比,模型组椎间盘髓核中整合素α5、β1、Fn蛋白表达量显着降低（P<0.01）;与模型组相比,针刀组整合素α 5、β 1、Fn蛋白含量明显增加（P<0.01）。5.Real-time PCR法结果显示:与空白组相比,模型组椎间盘髓核中整合素α 5、β1、Fn mRNA相对表达量均显着降低（P<0.01）;与模型组相比,针刀组整合素α 5mRNA显着升高（P<0.01）,β 1mRNA相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）,Fn mRNA明显升高（P<0.05）。6.ELISA法显示:与空白组相比,模型组血液中IL-6相对表达量显着升高（P<0.01）;与模型组相比,针刀组血液中IL-6显着降低（P<0.01）。结论:1.由颈椎MRI结果可见,本实验所选取的“低头位加风寒湿刺激”模型具有可行性。2.针刀可以修复肌肉的紊乱排列,促进组织修复。3.针刀延缓颈椎间盘退变的可能机制是通过力学刺调整整整合素α5、β1和Fn的表达含量,减少炎症因子IL-6的释放,以达到延缓颈椎间盘退变的目的。
杨旸[2]（2021）在《埃克替尼耐药的非小细胞肺癌转移的机制研究》文中进行了进一步梳理目的:肺癌是全球发病率最高且最具侵袭性的恶性肿瘤之一。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）约占肺癌患者的80-85%,死亡率极高。晚期多发转移的NSCLC很难治愈,5年生存率仅为1-2%。转移是NSCLC预后不良的主要原因之一,常见远处转移部位包括脑、肝脏、脊椎以及肾上腺等。如何控制晚期NSCLC的转移是治疗成功与否的关键。自表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）的问世以来,绝大多数预后差死亡率高的EGFR突变阳性的NSCLC患者已经从中获益。但是,治疗过程中获得性耐药的出现严重影响了疗效,增加了肿瘤复发转移的机会。EGFR-TKI常见的耐药机制包括:T790M、C797S等基因的二次突变;K-RAS突变、PTEN缺失引起的下游通路变异;Met、IGF-1R等旁路信号激活以及EGFR-TKI介导的凋亡途径的损伤等。目前对EGFR-TKIs耐药机制的研究主要集中在增殖能力的提高和凋亡程度的降低,很少有研究关注耐药细胞转移能力的变化以及耐药相关基因对其转移能力的影响。然而大多数被诊断为EGFR-TKI耐药的患者频繁出现肿瘤转移的现象,现有研究也显示化疗和靶向药耐药的肿瘤细胞易发生EMT最终获得更强的转移能力。因此研究EGFR-TKI耐药后肿瘤是否更容易发生转移,特别是耐药后转移相关的潜在机制是必要且具有重要意义的。整合素是由α亚基和β亚基组成的异源二聚体家族,是介导细胞之间及细胞与细胞外基质机械粘附的细胞表面跨膜蛋白受体。整合素家族不仅参与细胞的生长、分化、增殖、凋亡等生命过程,更能促进肿瘤细胞的迁移及侵袭,并向转移的肿瘤细胞传递信号以确保它们在适当的位置定植并开始生长。现有研究报道Integrinα5在肺癌转移的淋巴结组织中高表达;integrinβ3的缺失增加肺癌细胞对传统化疗药物的敏感性。另有研究表明integrinβ1和integrinβ3的高表达可促进肺癌细胞对EGFRTKI的耐药。然而,整合素对TKI耐药肿瘤细胞迁移和侵袭的影响尚不清楚。既往研究显示,整合素家族在不同非小细胞肺癌患者中表达存在差异,功能也不尽相同,我们推测这种差异表达和肿瘤异质性可能影响患者预后。因此,我们希望通过公共数据库的患者进行生存分析,寻找到整合素中影响预后的关键分子,并构建生存预测模型,为整合素分子发挥临床价值提供思路。在本研究中,我们建立了稳定的埃克替尼耐药的NSCLC细胞系,与亲本细胞相比耐药细胞转移能力明显增强。通过全转录组测序和在线生信分析,筛选出在耐药细胞中上调的integrinα5作为靶基因。敲减integrinα5后,耐药细胞迁移及侵袭能力明显下降。敲减integrinα5后联用埃克替尼,耐药细胞转移能力被抑制最明显,但联用只能部分逆转埃克替尼耐药。敲减integrinα5后,FAK、STAT3、AKT的磷酸化蛋白水平明显下调,提示integrinα5通过FAK-STAT3/AKT信号通路在耐药细胞中发挥关键作用。基于整合素家族,利用TCGA肺腺癌数据分析筛选出对肺腺癌预后起到关键作用的分子ITGA5,ITGA6,ITGAL。构建影响肺腺癌预后的特异性3-整合素预测模型并进行验证,用于精准评估肺腺癌患者预后。方法:1.MTT实验检测细胞增殖能力。2.集落形成实验检测细胞克隆形成能力。3.划痕实验检测细胞迁移能力。4.Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。5.Western blot实验检测细胞的integrinα5,integrinβ4,p-FAK,FAK,p-STAT3,STAT3,p-SRC,SRC,p-ERK,ERK,p-AKT,AKT,p-ERK,ERK,actin蛋白表达。6.si RNA转染细胞敲减integrinα5。7.生信分析及全转录组测序:Illumina Human HT12 v3 Bead Chip进行基因表达芯片分析;下载来自GEO数据集并用GEO2R分析获得差异表达基因;KEGG进行通路富集分析。8.TCGA数据库中下载肺腺癌数据,并将探针名进行转换,并于临床信息进行匹配。9.单因素及多因素COX回归用于寻找可能影响预后的关键分子,并利用多因素COX回归的结果,根据回归系数构建模型。10.利用ROC曲线评价新模型与经典模型的优劣,并分析新模型与临床病理学参数之间的关系。11.统计学分析:所有实验重复3次,结果用均值±标准差表示。应用SPSS 16.0进行统计分析,T检验及One-way ANOVA用于组间比较,p<0.05具有统计学意义。结果:1.埃克替尼耐药细胞系PC9/Ico R和827/Ico R对埃克替尼耐药。将亲本细胞PC9和HCC827暴露于埃克替尼中并逐渐增加药物浓度,最终建立终浓度分别为10μmol/l和5μmol/l的耐药细胞系PC9/Ico R和827/Ico R。48h MTT结果显示,埃克替尼对亲本细胞的增殖抑制作用呈剂量依赖性,而对耐药细胞增殖能力无明显影响。集落形成实验也得到类似的结果:埃克替尼对耐药细胞的集落形成没有明显抑制作用。而24小时MTT结果显示:短时间药物作用对亲本和耐药细胞均没有明显生存抑制作用。这些结果证实了埃克替尼不能抑制耐药细胞增殖,即我们建立了稳定的耐药细胞系。2.耐药细胞的迁移和侵袭能力比亲本细胞增强。划痕实验结果显示耐药细胞827/Ico R和PC9/Ico R的迁移速度比亲本细胞的迁移速度快,埃克替尼处理能够抑制亲本细胞迁移,但对耐药细胞没有明显影响。Transwell结果表明,827/Ico R和PC9/Ico R细胞通过小室滤膜或基质胶的数量明显多于HCC827和PC9细胞。同样,埃克替尼处理只能减少亲本细胞的迁移和侵袭,但对耐药细胞影响不明显。以上这些结果表明:与亲本细胞相比耐药细胞的迁移和侵袭能力明显增强,而埃克替尼只能抑制亲本细胞的迁移和侵袭能力,对耐药细胞的转移能力几乎没有影响。3.integrinα5在埃克替尼耐药细胞中表达增加。为明确耐药细胞迁移和侵袭能力增强的原因,我们首先研究细胞的基因芯片筛选得到在PC9/Ico R细胞中较PC9细胞上调的基因,并用KEGG通路富集分析得到排名前20位的通路并筛选得到与转移相关的Focal adhesion和ECM-receptor interaction通路。利用GEO数据库中的芯片数据集GSE62504,下载EGFR突变的NSCLC细胞系HCC827及HCC827/BR的基因芯片数据,并用KEGG富集分析差异基因得到黏着斑通路。将以上3条通路做交集并在其中筛取出我们感兴趣的整合素家族基因integrinα5和integrinβ4。Western blot进一步验证上述结果:integrinα5在耐药细胞827/Ico R和PC9/Ico R中的蛋白表达水平分别较亲本细胞HCC827和PC9上调。而integrinβ4的表达水平仅在PC9/Ico R耐药细胞中上调,而在827/Ico R耐药细胞中下调。鉴于上述结果,integrinα5可能在埃克替尼耐药细胞系中发挥关键作用。4.integrinα5促进埃克替尼耐药细胞的迁移和耐药。Western blot结果显示:与NC相比,用si RNA（序列1和序列2）转染耐药细胞827/Ico R和PC9/Ico R敲减integrinα5后,integrinα5蛋白的表达几乎完全被抑制。Transwell实验结果显示:与NC相比,敲减integrinα5后的827/Ico R和PC9/Ico R细胞穿过滤膜的数量明显减少。当敲减integrinα5后联用埃克替尼,耐药细胞的迁移能力下降最明显。除此之外,MTT结果显示:敲减integrinα5仅可以部分恢复耐药细胞827/Ico R和PC9/Ico R对埃克替尼的敏感性。5.integrinα5通过FAK/STAT3/AKT通路促进埃克替尼耐药细胞的迁移。为了进一步阐明integrinα5在耐药细胞转移过程中的作用机制,我们用Western blot检测integrinα5的下游途径。结果显示:p-FAK、p-STAT3、p-AKT和p-ERK在耐药细胞PC9/Ico R和827/Ico R中的蛋白水平远高于亲本细胞PC9和HCC827。当用埃克替尼作用于亲本细胞后,p-FAK、p-STAT3和p-AKT的蛋白水平显着下调,而埃克替尼处理的耐药细胞中p-FAK、p-STAT3和p-AKT的蛋白水平没有明显变化,这与transwell迁移实验结果一致。用si RNA敲除耐药细胞中integrinα5后,p-FAK、pSTAT3和p-AKT的蛋白表达水平明显下降。用STAT3抑制剂stattic作用于耐药细胞后,p-STAT3,p-AKT蛋白水平均明显下调,而p-FAK蛋白水平无明显变化。以上结果强烈提示integrinα5/FAK/STAT3/AKT信号通路在埃克替尼耐药细胞中起重要作用。6.AKT活化促进埃克替尼耐药细胞的迁移。为验证下游AKT在耐药细胞中对转移的影响,分别用埃克替尼、AKT抑制剂LY294002及两者联合作用于PC9/Ico R细胞。分别用Western blot检测p-AKT蛋白水平的变化,用transwell迁移实验检测细胞迁移能力的变化。Western blot结果示:当埃克替尼单独作用时,p-AKT蛋白水平未见明显变化;当LY294002作用时,p-AKT蛋白表达下调;当埃克替尼与LY294002联用时,p-AKT蛋白表达下降最明显。Transwell迁移实验结果显示:当埃克替尼单独作用时,穿过小室滤膜细胞的数量无明显变化;LY294002单独作用时,迁移细胞数量明显减少;当两药联合作用时,细胞迁移能力被抑制最为明显。以上结果提示:下游AKT活化促进埃克替尼耐药细胞的迁移。7.TCGA数据库中332例肺腺癌患者的转录组测序结果显示,整合素家族基因表达存在明显个体差异,进一步利用单因素及多因素COX回归,筛选出关键整合素分子ITGA5,ITGA6,ITGAL。8.利用回归系数构建风险评分模型,根据最佳Cut-off值将所有样本分为高表达组及低表达组,Kaplan-Meier生存分析显示两组生存时间存在显着差异。并且风险评分高的患者T分期、N分期、M分期均较晚。9.T分期+N分期+RS评分无论在短期或长期随访中均具有较好的预测价值,1年,3年,5年的时间依赖性ROC曲线的AUC值分别为0.735,0.731,0.741,均高于经典评价模型。结论:1.埃克替尼耐药的NSCLC细胞转移能力较亲本细胞明显增强。2.integrinα5的上调显着促进埃克替尼耐药NSCLC细胞的迁移及侵袭,但对促进耐药细胞增殖的作用不明显。3.integrinα5通过FAK/STAT3/AKT通路促进埃克替尼耐药NSCLC细胞的转移。4.ITGA5,ITGA6和ITGAL与肺腺癌预后显着相关,以它们为基础建立的整合素家族特异3-基因模型可以有效预测肺腺癌患者的预后。5.T分期+N分期+RS危险评分模型具有潜在的肺腺癌预后预测价值,可为临床诊断提供帮助。
张婕[3]（2018）在《缺血性中风恢复期证素关联分析及健脾补土方对体外神经元低氧损伤后凋亡的影响》文中研究指明【目的】1.通过整理缺血性中风恢复期证素相关文献,总结恢复期证素之间的关联,了解其病因病机的演变,并为后续实验研究提供一定依据。2.观察健脾补土组方对体外胎鼠原代皮层神经细胞低氧损伤后凋亡及INT-FAK通路下游凋亡相关Bax、Bcl-2、MEK、Erk2表达的影响,探讨健脾补土方对神经细胞凋亡的干预机理。【方法】1.基于文献研究对缺血性中风恢复期证素进行关联分析:采用计算机检索方法,检索2007年2017年中国生物医学文献数据库（CBM）、中国期刊全文数据库（CNKI）、维普期刊资源整合服务平台（VIP）中关于缺血性脑中风恢复期证素的相关文献进行收集整理,应用SQL Server 2012MAddin数据挖掘软件、采用Apriori算法对缺血性中风恢复期的证素进行关联规则分析处理,总结缺血性脑中风恢复期常见证素及其之间的关联。2.分离孕17d SD大鼠的胎鼠原代神经元,接种于六孔板中培养,并分为A正常血清对照组、B低氧损伤模型组、C低氧+神经生长因子组、D低氧+健脾补土血清组、E低氧+健脾补土血清+FAK抑制剂组5组。采用培养箱低氧/复氧的方法诱导后四组标本神经元凋亡形成脑缺血损伤模型,运用流式细胞术检测神经元凋亡情况,RT-q PCR法检测Bax、Bcl-2、MEK、Erk2 mRNA的表达,Western blot和免疫细胞化学法检测Bax、Bcl-2、MEK、Erk2蛋白的表达。【结果】1.关联分析结果:缺血性中风恢复期常见的病位证素主要有5个,分别为:脑、心、脾、肾、肝;病性证素主要有4个,分别为:气虚、血瘀、痰浊、阴虚。（1）病位证素关联:脑与心的关联性最高,其次依次为脑与肾、脑与脾、心与脾等。（2）病性证素关联:关联性最高的是气虚与血瘀,其次依次为血瘀与痰浊、气虚+痰浊与血瘀、气虚与痰浊、阴虚与血瘀。2.体外实验:（1）神经元凋亡率:与正常血清对照组比较,低氧损伤模型组凋亡率明显增加,差异具有统计学意义（P<0.01）;与低氧损伤模型组比较,低氧+神经生长因子组和低氧+健脾补土血清组均显着减少,差异有统计学意义（P<0.05）;与低氧+神经生长因子组比较,健脾补土组相对减少,差异无明显统计学意义（P>0.05）;与低氧+健脾补土血清组比较,低氧+健脾补土血清+FAK抑制剂组神经元凋亡率显着增加,差异有统计学意义（P<0.05）。（2）Bax、Bcl-2、MEK、Erk2 mRNA与蛋白表达情况:与正常血清对照组比较,低氧损伤模型组神经元Bax、MEK、Erk2 mRNA及蛋白表达显着升高,Bcl-2 mRNA及蛋白表达明显减少,差异均有统计学意义（P<0.01）;与低氧损伤模型组比较,低氧+神经生长因子组和低氧+健脾补土血清组中神经元Bcl-2 mRNA及蛋白表达显着升高,Bax、MEK、Erk2 mRNA及蛋白表达明显减少,差异均有统计学意义（P<0.05）;与低氧+神经生长因子组比较,健脾补土组神经元Bcl-2 mRNA及蛋白表达稍升高,Bax、MEK、Erk2 mRNA及蛋白表达稍减少,差异无明显统计学意义（P>0.05）;与低氧+健脾补土血清组比较,低氧+健脾补土血清+FAK抑制剂组神经元Bax、MEK、Erk2 mRNA及蛋白表达显着升高,Bcl-2 mRNA及蛋白表达明显减少,差异均有统计学意义（P<0.05）。【结论】1.通过整理缺血性中风恢复期的文献,采用数据挖掘之关联分析的方法,揭示缺血性中风恢复期的中医证素分布具有一定的规律,其病位证素主要为脑、心、脾、肾,病性证素主要为气虚、血瘀、痰浊、阴虚。各病位病性相互联系,随着疾病的演变,相互夹杂或转化,其规律更清楚地展现了缺血性中风恢复期的证素特点及病机演变,并发现“脑”与“脾”强关联及“气虚”、“血瘀”、“痰浊”之间演变与“脾”功能相关的特点,从病因病机上为课题组健脾补土方治疗缺血性中风提供了一定的理论及文献支持。2.通过体外神经元低氧/复氧损伤后凋亡模拟脑缺血性再灌注损伤模型,研究健脾补土方对神经元凋亡以及特定基因FAK表达被阻断情况下的Bax、Bcl-2、MEK、Erk2 mRNA及蛋白表达情况,探讨健脾补土组方对体外神经元凋亡的干预机理,其结论如下:A.健脾补土方能减少体外神经元凋亡。B.其作用机制可能通过激活INT-FAK通路,上调FAK的表达,通过Raf/MEK/ERK激酶信号途径,发生进一步级联反应,抑制凋亡相关MEK、Erk2、Bax表达,增加Bcl-2表达,从而达到抑制神经元细胞凋亡,起到保护脑缺血损伤的作用。
陈晓[4]（2016）在《miR-338在肺癌中的表达及其通过靶向作用于整合素β3抑制肺癌转移的研究》文中认为背景及目的肺癌是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤,己经成为全球癌症相关死亡的主要原因。肺癌可分为小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）两类。手术、化疗、靶向治疗及放疗是肺癌的主要治疗手段。尽管目前肺癌的诊治水平不断进步,但肺癌患者长期生存并不乐观,总体5年生存率只有10%-20%。局部复发和远处转移是导致肺癌患者死亡的主要原因。肺癌的发生、发展是多基因改变共同作用的结果,涉及到多种癌基因的激活和抑癌基因的失活。目前基因靶向治疗己经成为肺癌研究的新热点,发现和认识新的治疗靶点并用于肺癌的诊断和治疗,具有重要的临床价值及重大的现实意义。微小RNA（miRNA,microRNA）长度为19-25个核苷酸的小非编码RNA,广泛存在于动植物体内,影响许多蛋白编码基因的表达。miRNA通过与靶m RNA特异结合可以抑制靶m RNA翻译或降解靶m RNA。miRNA参与调控细胞分化、增殖、生长、迁移、凋亡等许多细胞行为。miRNA表达异常在肿瘤发生、进展和复发中发挥重要作用,扮演着抑癌或促进癌症的作用。miR-9、miR-92b、miR-224和miR-183等为癌基因并促进肺癌转移。miR-101、miR-133a和miR-141等为抑癌基因,可以显着抑制肺癌细胞转移。此外,与肺癌相关的存在于血液,血清,血浆和唾液中的miRNA同样在肺癌中发挥着重要的作用,使miRNA成为一种新的肿瘤标志物。整合素（integrin,ITGB）属于细胞表面分子,是一类由α和β亚基以非共价键形式结合组成的跨膜蛋白受体,介导细胞之间以及细胞与细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的粘附。整合素因其跨膜结构的特殊性而具有双向信号转导功能。目前已发现18种α亚基和8种β亚基,可形成24种异源二聚体,分布于全身不同组织和器官,发挥各自的生物学功能。同时,整合素也与疾病的发生和发展密切相关,其信号转导途径也能参与肿瘤的发生和发展。整合素的突变或异常表达通常被认为与肿瘤的发生和转移相关。整合素β3（integrin beta3,ITGB3）属于β亚基中的一员,在全身不同组织中均有表达,参与多种生物学过程,发挥不同的生理功能。ITGB3是多种蛋白质（诸如纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、基质金属蛋白酶-2、骨调蛋白和玻连蛋白）的共同受体。已在各种恶性肿瘤中观察到ITGB3表达高度升高。ITGB3对于急性粒细胞性白血病（Acute myeloid leukemia,AML）发生发挥关键作用,使其成为潜在治疗靶点。有研究证实ITGB3是诱发结直肠癌细胞迁移和侵袭的一种重要调节因子。在乳腺癌中,m RNA表达谱排列表明,转移性肿瘤细胞的一些血管生成相关蛋白（包括ITGB3）显着上调。此外,最新研究证明,肺癌组织中表达下调的let-7c,通过靶向作用于ITGB3抑制肺癌细胞的迁移和侵袭。miR-338家族（miR-338,miR-338-3p,miR-338-5p）位于凋亡相关酪氨酸激酶7号内含子上。已经证实miR-338在肝细胞癌、口腔癌和食管鳞状细胞癌中表达下调。miR-338过度表达可以抑制胃癌细胞增殖并促进细胞凋亡。肝细胞癌中的miR-338水平恢复可使癌细胞对索拉非尼治疗敏感。研究已经证实,miR-338能够通过靶向作用于Smoothened抑制结直肠癌细胞侵袭和迁移。但仍然不清楚miR-338在肺癌转移中的作用机制。在本研究中,我们尝试使用实时荧光PCR（q RT-PCR）检测评估5个肺癌细胞株、1个人肺成纤维细胞MRC-5细胞株及115例肺癌组织、癌旁正常肺组织中miR-338的表达。构建miR-338过表达肺癌细胞株,探索在体外环境下miR-338对肺癌细胞增殖、粘附、迁移及侵袭的影响。并检测miR-338过表达肺癌细胞株中ITGB3蛋白质的表达,初步研究miR-338抑制肺癌转移的分子靶向作用机制。本课题包含以下三个部分:第一部分:miR-338在肺癌细胞株及肺癌组织中的表达及意义;第二部分:上调miR-338表达对肺癌细胞株A549、NCI-H292生物学行为的影响;第三部分:miR-338通过靶向作用于整合素β3抑制肺癌转移。第一部分miR-338在肺癌细胞株及肺癌组织中的表达及意义方法:1、培养5个肺癌细胞株（A549、NCI-H292、NCI-H460、NCI-H446、NCI-H1299）和1个人肺成纤维细胞MRC-5细胞株。2、收集手术切除的115例肺癌组织及相对应的癌旁正常肺组织标本。3、提取所有细胞株和115例肺癌组织及相对应的癌旁正常肺组织的RNA,并用q RT-PCR检测miR-338的表达。4、分析肺癌组织中的miR-338表达与患者性别、年龄、吸烟史、肿瘤大小、肿瘤癌栓、淋巴结转移、肿瘤复发及TNM分期之间的相关性。5、使用SPSS 13.0对数据进行分析,并以平均值±标准差的形式表示。使用配对样本t检验估计两组间差异。使用单因素方差分析（ANOVA）分析miR-338表达与临床病理因素之间关系,并使用对数秩检验根据Kaplan-Meier法划出生存曲线。如果p<0.05,则认为组间差异具有统计学意义。结果:1、与人肺成纤维细胞MRC-5细胞相比,所有肺癌细胞株中的miR-338表达显着下调（A549 1.0vs0.15±0.01、NCI-H292 1.0vs0.35±0.12、NCI-H4601.0vs0.3±0.02、NCI-H446 1.0vs0.25±0.07、NCI-H1299 1.0vs0.275±0.01,p<0.05）。2、与癌旁正常肺组织相比,115例肺癌组织中的miR-338表达显着下调（0vs-2.99±3.69,p<0.001）。肺癌组织中的miR-338表达降低与患者性别、年龄、吸烟史、肿瘤大小和淋巴结转移无关（p>0.05）。miR-338表达降低与肿瘤癌栓、肿瘤复发、TNM分期相关（p值分别为0.005、0.004、0.025）。低miR-338表达组的5年总生存率显着低于高miR-338表达组（中位生存时间44个月vs53个月,P=0.001）。第二部分:上调miR-338表达对肺癌细胞株A549、NCI-H292生物学行为的影响方法:1、构建、培养重组miR-338慢病毒感染的A549、NCI-H292细胞细胞株,用q RT-PCR检测细胞中miR-338的表达。2、CCK-8法检测重组miR-338慢病毒感染的A549、NCI-H292细胞及对照细胞增殖和生长能力。3、检测重组miR-338慢病毒感染的A549、NCI-H292细胞及对照细胞粘附能力。4、Transwell小室实验检测重组miR-338慢病毒感染的A549、NCI-H292细胞及对照细胞的迁移及侵袭能力。5、裸鼠移植瘤模型实验检测重组miR-338慢病毒感染的NCI-H292细胞及对照细胞对裸鼠肺移植瘤的影响。6、使用SPSS 13.0对数据进行分析,并以平均值±标准差的形式表示。使用配对样本t检验估计两组间差异。如果p<0.05,则认为组间差异具有统计学意义。结果:1、重组miR-338慢病毒感染的A549、NCI-H292细胞较对照细胞miR-338的表达明显升高（A549 646.37±35.45vs23.05±3.56、NCI-H292330.86±11.05vs10.54±2.35,P<0.05）。成功构建了高表达miR-338的肺癌细胞株。2、在体外环境下上调miR-338的表达可以抑制A549、NCI-H292肺癌细胞的增殖（P<0.05）、粘附（A549平均细胞计数1233±249vs310±22,p=0.035）（NCI-H292平均细胞计数180±16vs72±10,p=0.028）、迁移（A549平均细胞计数347±41vs190±8,p=0.029）（NCI-H292平均细胞计数287±33vs127±21,p=0.045）及侵袭能力（A549平均细胞计数197±12vs68±14,p=0.008）（NCI-H292平均细胞计数106±10vs41±3,p=0.006）。3、裸鼠异种移植肿瘤模型实验表明,miR-338高表达能有效地抑制裸鼠肺移植瘤的生长（平均肿瘤克隆数20±7vs4±2,p=0.004）。第三部分miR-338通过靶向作用于整合素β3抑制肺癌转移方法:1、生物信息学分析推测ITGB3为miR-338靶基因。2、用Western免疫印迹检测miR-338过度表达肺癌细胞株A549和NCI-H292及对照细胞中的ITGB3蛋白质表达。3、双荧光素酶报告检测验证miR-338靶基因。4、使用SPSS 13.0对数据进行分析,并以平均值±标准差的形式表示。使用配对样本t检验估计两组间差异。如果p<0.05,则认为组间差异具有统计学意义。结果:1、miR-338过表达肺癌细胞株A549和NCI-H292中的ITGB3蛋白质表达较对照细胞均明显降低（A549 1.0vs0.35±0.04,p<0.001）（NCI-H2921.0vs0.69±0.07,p=0.01）。2、双荧光素酶报告检测结果显示miR-338过表达组的荧光素酶活性较对照组降低（A549 1.0vs0.75±0.08,p=0.03）（NCI-H292 1.0vs0.62±0.06,p=0.008）。结论:1、在肺癌细胞株及肺癌组织中,miR-338表达水平较正常细胞及组织显着降低。在肺癌组织中miR-338表达水平与患者性别、年龄、吸烟史、肿瘤大小和淋巴结转移无关,而与肿瘤癌栓、肿瘤复发、TNM分期相关。低miR-338表达组的5年总生存率显着低于高miR-338表达组。2、体外上调肺癌细胞中miR-338表达水平可有效抑制肺癌细胞的增殖、粘附能力,降低肺癌细胞的迁移和侵袭能力。3、miR-338是通过作用于靶基因ITGB3 mRNA3’UTR区,从而对其表达产生负调控作用。miR-338发挥抑癌作用。ITGB3是一种新的miR-338肺癌靶基因,为肺癌基因治疗潜在的新靶点。
刘金禄[5]（2015）在《siRNA沉默CLIC1基因对人胃癌细胞生物学行为的影响及相关机制的体外研究》文中提出第一部分siRNA CLIC1重组慢病毒载体及低表达CLIC1稳转胃癌细胞株的构建及鉴定目的:用前期实验筛选获得的CLIC1 siRNA3片段构建重组慢病毒载体,进一步构建稳定低表达CLIC1的单克隆胃癌细胞株,实时荧光定量PCR筛选抑制率最好的单克隆胃癌细胞株。方法:（1）直接用前期研究已经筛选出的CLIC1 siRNA3为沉默CLIC1基因的最有效片段。制备双链DNA oligo,利用基因重组技术克隆到慢病毒表达载体GV115中,双酶切后行DNA测序鉴定重组慢病毒载体。将慢病毒包装辅助质粒和制作的含CLIC1 siRNA的重组慢病毒载体共转染293T细胞,收集病毒颗粒并用孔稀释法测定病毒滴度。另外,利用上海吉凯公司的阴性序列病毒作为阴性对照。（2）将病毒分别感染胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803,各挑取6组GFP强表达的细胞克隆团转移种植建立两稳定单克隆细胞株,荧光定量PCR检测CLIC1抑制率,选取抑制率最好的克隆组。结果:经测序成功构建针对CLIC1的重组慢病毒RNA干扰表达载体;利用293T细胞包装重组慢病毒载体后成功收集到重组慢病毒颗粒,其病毒滴度为:1.2E+9 TU/mL;利用重组慢病毒颗粒感染两株胃癌细胞,感染效率均在80%以上;成功扩增并分别获得6组稳定低表达CLIC1的单克隆胃癌细胞株;荧光定量PCR鉴定获得抑制效率最好的单克隆胃癌细胞株;SGC-7901和MGC-803单克隆株的CLIC1抑制率分别为89.3%和93.8%。结论:成功构建CLIC1 siRNA干扰慢病毒载体,并成功获得抑制效率较好的低表达CLIC1稳转胃癌细胞株,为下一步探讨沉默CLIC1对胃癌生长的体内体外实验奠定良好的基础。第二部分siRNA沉默CLIC1基因表达后对胃癌细胞生物学行为的影响目的:探讨siRNA干扰CLIC1基因表达后对胃癌细胞生物学行为的影响。方法:用MTT法检测抑制CLIC1表达前后细胞的增殖情况;用AnnexinV-APC单染进行流式细胞技术检测,观察抑制前后各组细胞凋亡变化情况;用PI单染的方法检测各组细胞周期变化情况;用Transwell小室及Matrigel胶检测细胞侵袭和迁移能力的变化。结果:转染后24h、48h、72h、96h、120h干扰组A值均低于空白对照组和阴性对照组（均P<0.05）;SGC-7901干扰组转染后24h、48h、72h、96h、120h 的细胞增殖率分别为 27.829%、52.663%、71.785%、28.778%和20.450%;MGC-803 干扰组分别为 16.910%、42.169%、127.244%、101.388%和34.118%。SGC-7901（干扰组vs空白对照组vs阴性对照组%:0.743±0.031 vs 0.587±0.025 vs 0.597±0.032,F=26.628,P<0.01）和 MGC-803（干扰组vs空白对照组vs阴性对照组%:4.370±0.125 vs 1.453±0.166 vs 1.510±0.079,F=506.432,P<0.01）干扰组的细胞凋亡率均显着高于各自的空白对照组和阴性对照组。在SGC-7901细胞中,干扰组G0/G1期比例显着低于空白对照组及阴性对照组（F=172.299,均P<0.01）,G2/M期比例显着高于空白对照组及阴性对照组（F=2665.338,P<0.01）;在MGC-803细胞中,G2/M期细胞比例干扰组也显着高于空白对照组及阴性对照组（F=631.560,P<0.01）,G0/G1及G2/M期细胞比例均显着低于空白对照组及阴性对照组（F=889.621,P<0.01）。干扰组侵袭、迁移实验中的穿膜细胞数（SGC-7901 分别是:86.000±6.000、118.333±8.505,MGC-803:81.333±5.033、108.667土8.327）均显着低于空白对照组（SGC-7901分别是:156.667±14.843、181.667±11.719,MGC-803:168.333±17.388、185.000±11.000）和阴性对照组（SGC-7901 分别是 150.333±13.051、178.667土7.024,MGC-803:161.000土 15.716、179.333土10.408）（均 P<0.01）。结论:抑制CLIC1表达后胃癌细胞SGC-7901和MGC-803增殖增快、凋亡增加、细胞周期阻滞在G2/M期、侵袭迁移能力受到抑制。提示抑制CLIC1是胃癌基因治疗的一个潜在有效的靶点。第三部分基于iTRAQ蛋白组学技术筛选抑制CLIC1表达前后胃癌细胞SGC-7901中的差异表达蛋白目的:应用iTRAQ结合质谱分析的蛋白组学技术分析对比抑制CLIC1表达前后胃癌细胞SGC7901的差异表达蛋白。方法:提取两组细胞的总蛋白,经蛋白质酶解、iTRAQ标记、质谱分析和数据库搜索等步骤后,筛选出符合条件的蛋白质:114/115的比值≥2.0或≤0.5;最后对差异蛋白进行生物信息学分析。结果:抑制CLIC1表达后在Human数据库中共鉴定到1170个蛋白肽段,差异蛋白54个,36个上调表达,18个下调表达;Mouse数据库中鉴定到858个蛋白肽段,差异蛋白39个,上调表达24个,下调表达15个。差异蛋白主要定位于细胞内,以结合作用和生物调节作用为主。结论:筛选出了一组与CLIC1沉默相关的差异蛋白,为明确CLIC1在胃癌中的作用机制提供了线索和基础。第四部分siRNA抑制CLIC1基因表达后对胃癌细胞整合素和凋亡基因mRNA及蛋白的影响目的:探讨抑制CLIC1表达后胃癌细胞中部分凋亡和整合素相关基因及蛋白的表达情况。方法:应用实时荧光定量PCR和Western blot检测胃癌细胞中整合素（α1、α3、αv、β 1）和凋亡（Bcl-2、survivin、Fas）相关基因和蛋白的表达情况。结果:（1）SGC-7901和MGC-803干扰组细胞中整合素α3、αv和β1基因表达均显着下降（SGC-7901:52.547%、33.766%、34.132%和 MGC-803:56.500%、51.900%、76.347%）（均P<0.05）,α1 在 SGC-7901 中表达升高（干扰组vs空白对照组vs阴性对照:1.705±0.096 vs 1.000±0.014 vs 0.931±0.016）,在 MGC-803 中表达下降（0.503±0.059 vs 1.000土0.038 vs 1.011 土0.059）,差异均有统计学意义（均P<0.05）。（2）两组细胞中整合素 α3、αv和β1 蛋白表达均显着下降（SGC-7901:70.924%、35.491%、55.209%和 MGC-803:46.729%、53.765%、70.935%）（均P<0.05）,α1 在 SGC-7901中表达干扰组高于空白对照组和阴性对照组（1.577±0.021 vs 0.610±0.046 vs 0.650±0.044）,在 MGC-803 中表达下降（0.607±0.031 vs 1.123±0.040 vs 1.110±0.046）,差异均有统计学意义（均P<0.05）。（3）两干扰组中Bcl-2基因和蛋白的表达均下降（mRNA:65.200%和74.725%,蛋白:60.023%和54.023%）（均P<0.05）,Fas基因和蛋白的表达均上升（mRNA:97.702%和 173.826%,蛋白:83.091%和 76.935%）（均P<0.05）,survivin 表达不变（P>0.05）。结论:（1）从基因和蛋白水平检测发现沉默CLIC1表达后两株胃癌细胞中的整合素α3、αv、β1均下调表达;胃癌细胞SGC-7901中的整合素α1上调表达,MGC-803中则下调表达。结合整合素在肿瘤中的作用,初步认为CLIC1基因沉默通过调节整合素的表达影响胃癌的进展。（2）抑制胃癌细胞SGC-7901和MGC-803中的CLIC1表达后凋亡蛋白Fas表达上调、Bcl-2表达下调、Survivin表达无变化。结合第二部分生物学功能实验结果,Fas和Bcl-2表达的变化能促进沉默CLIC1表达后胃癌细胞SGC-7901和MGC-803的凋亡。
王凤霞[6]（2013）在《中华真地鳖（Eupolyphaga sinensis）抗肿瘤蛋白分离纯化及其体外抗转移活性研究》文中认为中华真地鳖（Eupolyphaga sinensis Walker）,俗称土鳖、土元等,属于蜚蠊目（Blattodea）,鳖蠊科（Corydiidae）,地鳖亚科（Polyphaginae）,真地鳖属（Eupolyphaga）昆虫,目前已实现大规模人工养殖。中华真地鳖作为一种传统中药,在我国具有悠久的药用历史。现代研究表明,中华真地鳖具有溶解血栓、抗凝血、抗肿瘤、促进骨折愈合、调节血脂等十分广泛的药理作用。对于中华真地鳖的研究,国外学者很少涉及,其研究近乎空白。近年来,国内学者研究表明中华真地鳖蛋白提取物能够抑制血管生成和肿瘤生长。可见,蛋白组分被认为是中华真地鳖的抗肿瘤有效组分。但是,到目前为止,尚未见中华真地鳖抗肿瘤蛋白成分的报导。我们利用现代生化分离技术,从中华真地鳖新鲜雌虫体中分离纯化得到一分子质量约为72kDa的抗肿瘤蛋白,命名为EPS72。该蛋白对人肝癌细胞株Bel-7402、肺癌细胞株A549等多种人癌细胞株表现出较强的增殖抑制作用。以A549细胞作为体外肿瘤模型,研究了EPS72对细胞形态、增殖、凋亡、粘附、伸展、迁移以及侵袭的影响,发现EPS72具有体外抗肿瘤转移活性,并初步探讨了EPS72体外抗肿瘤转移可能的分子机制。期望为EPS72进一步开发利用提供一定的线索,同时为抗肿瘤蛋白类药物的研究提供一些新的思路。本课题的主要研究内容及结果有以下几个方面：1中华真地鳖抗肿瘤蛋白的提取、纯化及鉴定首先采用硫酸铵分级沉淀（50%-80%饱和度）、超滤（截留分子质量为10kDa）和冷冻干燥技术获得蛋白粗提物（组分Ⅰ）。由组分Ⅰ得到抗肿瘤活性蛋白的纯化方案由捕获、中度纯化和精制三个步骤组成：（1）捕获：分别采用CM-Sepharose FF阳离子交换色谱和DEAE-Sepharose FF阴离子交换色谱对抗肿瘤有效活性组分进行捕获；（2）中度纯化：分别采用Q-Sepharose HP阴离子交换色谱和Butyl Sepharose HP疏水色谱进行中度纯化；（3）精制：采用Superdex75凝胶过滤色谱进行精制。整个纯化过程中采用280nm检测蛋白质洗脱情况,分别收集各洗脱峰,采用MTT法追踪抗肿瘤活性组分,最后得到的活性组分进行冷冻干燥即为纯化所得抗肿瘤蛋白（组分Ⅵ）。每1kg新鲜活虫材料大约可得到电泳纯的抗肿瘤蛋白56mg,蛋白得率0.0056%。活性组分Ⅵ在SDS-PAGE上显示为单一条带,表观分子质量约为72kDa,表明其达到了电泳纯;MALDI-TOF质谱结果表明其分子质量为71.737kDa,与SDS-PAGE结果基本吻合,说明纯化得到的抗肿瘤蛋白为单链蛋白,分子量约为72kDa,故命名为EPS72。2EPS72体外抗肿瘤活性研究MTT存活分析表明EPS72对肝癌Bel-7402细胞、肺癌A549细胞等多种人癌细胞株表现出较强的增殖抑制作用。接着以A549细胞作为体外肿瘤模型,研究了EPS72对细胞形态、凋亡、粘附、伸展、迁移以及侵袭的影响。相差显微镜下细胞形态学研究、台盼蓝染色计数、AO/EB染色以及JC-1检测细胞膜电位（△Ψm）结果表明,EPS72作用早期可诱导已贴壁生长的肿瘤细胞脱粘附,但是刚脱粘附细胞为胞膜完整的活细胞,撤药后能正常生长,而脱粘附细胞持续受药物作用后则会进一步诱导细胞凋亡性死亡。可见,EPS72诱导肿瘤细胞脱粘附的作用是直接的,而诱导细胞凋亡的作用是间接的。细胞粘附实验进一步表明,EPS72能够显着抑制肿瘤细胞向细胞外基质（ECM）蛋白成分纤粘连蛋白（fibronectin,FN）和Ⅳ型胶原蛋白（collagen Ⅳ,Col Ⅳ）的粘附,但对细胞向非ECM成分多聚赖氨酸（poly-L-lysine, PL）的粘附却没有影响。癌细胞体外伸展实验结果表明,EPS72能够抑制肿瘤细胞在ECM表面上伸展。创伤愈合实验表明EPS72能够阻止肿瘤细胞向创伤面迁移。Transwell实验进一步证明EPS72能够影响肿瘤细胞向Matrigel的侵袭能力。可见,EPS72通过影响肿瘤细胞的粘附、伸展、转移、侵袭及增殖、存活能力发挥体外抗肿瘤作用,EPS72具有体外抗肿瘤转移活性。3EPS72体外抗肿瘤作用的分子机制为了进一步探讨EPS72体外抗肿瘤转移的分子机制,利用荧光显微镜采用免疫荧光法研究了EPS72对细胞肌动蛋白骨架成分F-actin的影响；采用流式细胞仪和Western blotting技术研究了EPS72作用后肿瘤细胞β1-整合素和整合素关联蛋白激酶（ILK）表达情况。结果表明,EPS72作用后F-actin的聚合受到抑制,肿瘤细胞p1-整合素和ILK的表达受到抑制,推测EPS72可能通过直接靶向肿瘤细胞表面的β1-整合素,进而影响整合素—细胞骨架信号通路发挥体外抗肿瘤转移作用。本研究取得的成果和结论主要有：（1）采用现代生化分离技术,首次从中华真地鳖新鲜雌虫体中分离纯化得到一种分子量约为72kDa的抗肿瘤蛋白,命名为EPS72。该分离纯化工艺条件温和,操作简单,并易于规模化放大生产。（2）体外研究表明,EPS72对人肝癌Bel-7402细胞、肺癌A549细胞等人癌细胞株表现出较强的胞毒活性,而对非癌细胞株MRC5的细胞毒性较低,显示该活性蛋白具有较强的广谱抗肿瘤活性,且对肿瘤细胞显示出良好的选择性。（3）确定了EPS72通过影响肿瘤细胞的粘附、伸展、转移、侵袭及增殖、存活能力发挥体外抗肿瘤作用,EPS72具有体外抗肿瘤转移能力。（4）初步推测EPS72可能通过直接靶向肿瘤细胞表面的β1-整合素,进而影响整合素—细胞骨架信号通路发挥体外抗肿瘤转移作用。
张学兰[7]（2011）在《整合素β1表达上调对非小细胞肺癌EGFR TKI耐药的影响》文中认为背景和目的:在许多国家,肺癌是因癌症导致死亡的主要原因。由于早期肺癌缺乏症状,大约70%-80%的肺癌患者在确诊时已是晚期。大多晚期肺癌患者均接受铂类为基础的化疗,但是目前一线化疗疗效十分有限。而且非小细胞肺癌二线治疗的有效率并不理想,PFS仅在3个月。随着NSCLC分子发病机制逐渐阐明,针对这些分子发病机制的分子靶向治疗已成为了可能。目前NSCLC分子靶点治疗多集中在肿瘤细胞的表皮生长受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）上。其抑制剂（EGFR TKI）是一种受体酪氨酸激酶抑制剂,它与ATP竞争表皮生长因子受体特定结合位点,从而抑制酪氨酸酶的活性,在临床上已用于EGFR活化突变的非小细胞肺癌的患者的治疗。但很多患者在用药一段时间后,即出现耐药现象,甚至是病情加重。针对这种药物耐药机制的研究已成为近几年来研究的热点。目前关于耐药机制研究比较成熟的有EGFR T790M突变和c-met原癌基因的扩增。最近的研究表明整合素可调节上皮细胞粘附于细胞外基质（extracellular matrix, ECM）蛋白,诱导酪氨酸磷酸化,部分激活EGFR,而EGF也能提高整合素α2β1的表达。分析PC9细胞株以及在此基础上吉非替尼诱导的耐药细胞株时发现,大部分耐药株胶原的粘附能力远高于PC9,提示细胞粘附分子和细胞外基质可能参与吉非替尼的耐药[。另有研究发现分析PC9以及耐药细胞株发现,耐药细胞株整合素β1水平显着增高,整合素β1可能与吉非替尼获得性耐药有关本研究组旨在通过分析PC9细胞株基础上建立稳定表达整合素β1的亚细胞株PC9/D6以及空载体转染细胞株PC9/PCD,进一步从体内或体外水平进一步证实整合素β1表达上调影响吉非替尼的敏感性以及免疫组化检测移植瘤组织中蛋白的表达水平,更好地了解整合素β1是如何影响EGFR TKI的敏感性,为寻找新的耐药机制提供有力的依据。第一部分整合素β1表达上调对吉非替尼抑制细胞增殖的影响目的:评价三株NSCLC细胞株PC9（EGFR突变性）以及在此基础上脂质体稳定转染整合素β1细胞株PC9/D6和脂质体pcDNA 3.1稳定转染空白对照株PC9/PCD对吉非替尼的疗效,探讨整合素β1表达上调与吉非替尼耐药的关系。方法:PC9、PC9/PCD和PC9/D6三株细胞经0.5μmol/L吉非替尼作用后,用MTT法检测三株细胞不同时间点的细胞增殖情况。结果:1.吉非替尼对肺腺癌PC9细胞株有明显的抑制作用,并且这种抑制作用呈现出时间依赖性（P<0.05）2.吉非替尼对空白对照株PC9/PCD有明显的抑制作用,且这种抑制作用呈现出时间依赖性（P<0.05）。且PC9细胞株和PC9/PCD细胞株在相同时间点细胞增殖率并没有统计学差异。3.吉非替尼对高表达整合素β1细胞株PC9/D6的抑制作用明显减弱。与PC9细胞株和PC9/PCD细胞株比较发现,在不同时间点PC9/D6细胞株的增殖率与前两株细胞相比均具有明显统计学差异（P<0.01）,说明整合素β1表达的上调降低了细胞株对吉非替尼的敏感性。,但是吉非替尼仍能部分抑制PC9/D6细胞增殖,可见整合素β1可能参与了吉非替尼的部分耐药。第二部分整合素β1表达上调对吉非替尼抑制肿瘤生长的影响目的:探讨整合素β1表达上调对吉非替尼抑制肿瘤生长的影响。方法:建立PC9、PC9/PCD、PC9/D6三株细胞的裸鼠移植瘤模型,同时设治疗组和对照组（3mg/kg吉非替尼和1%Tween-80）,观察肿瘤的生长情况,描绘肿瘤生长曲线,至疗程结束,剥离肿瘤组织,称瘤重,同时计算抑瘤率。结果:1.吉非替尼对PC9细胞株裸鼠移植瘤模型有明显的抑制作用。至疗程结束,其治疗组和对照组的瘤重分别是（71.7±8.12）mg,（1364.86±259.173）mg,抑瘤率为95.16%。2.吉非替尼对PC9/PCD细胞株裸鼠移植瘤模型抑瘤作用明显。至28天疗程结束后,其抑瘤率为93.54%3.吉非替尼对PC9细胞株裸鼠移植瘤模型抑瘤作用相对较弱,且即使在给予吉非替尼治疗的同时,治疗组裸鼠移植瘤仍处于生长状态,只是相对于对照组而言,生长的速度延缓。与PC9和PC9/PCD治疗组比较,具有统计学差异（P<0.05）。第三部分移植瘤形态学检查及其组织中整合素β1、EGFR、pEGFR的表达情况目的:观察治疗组和对照组移植瘤形态学变化,检测组织中整合素β1、EGFR、pEGFR的表达情况.方法:剥离的肿瘤组织经4%的多聚甲醛固定,病理切片,同时取部分切片经苏木精-伊红染色;余切片采用免疫组化法检测整合素β1、EGFR、pEGFR的表达情况。结果:1.PC9、PC9/PCD治疗组与对照组相比,肿瘤细胞的排列较疏松,细胞核明显淡染。但PC9/D6组治疗组与对照组相比,肿瘤细胞仍较密集,细胞核未见明显淡染。2.整合素β1在PC9/D6组的表达强度明显高于PC9及其空白对照株PC9/PCD（P<0.01）,而三株细胞移植瘤治疗组与对照组相比,其整合素β1表达无统计学差异。三株细胞移植瘤中的EGFR表达无统计学差异,与是否给与吉非替尼处理无关。三株细胞移植瘤在接受吉非替尼治疗后,pEGFR均有不同程度的下降,对照组与治疗组比较有统计学差异（P<0.01）。而pEGFR在治疗组PC9/D6表达强度明显高于PC9, PC9/PCD（P<0.01）。结论:转染了整合素β1的细胞PC9/D6细胞增殖率明显高于PC9/PCD和PC9组。吉非替尼对PC9/D6裸鼠移植瘤生长抑制最不明显,抑制率是61.38%,与PC9/PCD、PC9组比较具有明显统计学差异, PC9/PCD、PC9的抑制率分别是93.54%,95.16%。PC9/D6裸鼠移植瘤中整合素β1的表达高于PC9/PCD,PC9。而EGFR在三者之间表达无统计学差异。三组裸鼠移植瘤经吉非替尼治疗后, pEGFR的表达均有不同程度的下降,但PC9/D6治疗组pEGFR的表达组显着高于PC9/PCD、PC9。无论体内或体外实验,整合素β1表达上调降低了细胞株或移植瘤对吉非替尼的敏感性。提示整合素β1可是一种新的耐药机制参与了EGFR TKI的耐药。
穆昱[8]（2011）在《整合素α6β4在非小细胞肺癌生长中的作用研究》文中研究指明目的：使用shRNA干扰技术,抑制整合素a6β4的表达,筛选稳定表达a6shRNA和β4 shRNA的非小细胞肺癌细胞株,体外实验研究整合素a6β4在非小细胞肺癌生长中的作用及其可能的机制,为非小细胞肺癌早期诊断和治疗提供新的靶点,为以整合素a6β4信号通路为靶点的肺癌治疗奠定理论基础。材料与方法：1.qRT-PCR验证稳定表达a6 shRNA和β4 shRNA的H460SM中整合素a6β4的表达水平,显微镜下观察细胞形态的变化。2.细胞计数、MTT、MTS实验分析敲除a6整合素表达的非小细胞肺癌细胞H460SM-75、H460SM-76,敲除B4整合素表达的非小细胞肺癌细胞H460SM-68、H460SM-71在体外的生长状况,研究抑制a6和B4整合素表达对非小细胞肺癌细胞生长的影响。3.流式细胞术分析敲除a6β4整合素表达对非小细胞肺癌细胞凋亡的影响。4.流式细胞术分析敲除a6β4整合素表达对非小细胞肺癌细胞周期分布的影响,初步研究抑制a6β4整合素表达对非小细胞肺癌细胞生长作用的可能机制。结果：1.与非特异性基因敲除的非小细胞肺癌细胞（H460SM-NS）相比,敲除a6整合素的非小细胞肺癌细胞（H460SM-75、H460SM-76）的a6整合素表达明显降低（P=0.001,P=0.000）；敲除B4整合素的非小细胞肺癌细胞（H460SM-68、H460SM-71）的B4整合素表达明显降低（P=0.000,P=0.000）。2.与非特异基因敲除非小细胞肺癌细胞（H460SM-NS）相比,敲除B4整合素的非小细胞肺癌细胞（H460SM-68、H460SM-71）的增殖明显减慢,敲除a6整合素的非小细胞肺癌细胞（H460SM-75、H460SM-76）的增殖无明显差异。3.非小细胞肺癌细胞H460SM-NS、H460SM-68、H460SM-71、H460SM-75、H460SM-76之间的凋亡率有差异,但没有统计学意义（P=0.071）。4.H460SM-68、H460SM-71在G0/G1期中的分布高于H460SM-NS在G0/G1期中的分布（P=0.017,P=0.013）,提示细胞周期可能被阻滞在G1/S检测点,导致H460SM-68、H460SM-71的增殖延迟。5.β4 shRNA稳定表达的非小细胞肺癌细胞H460SM-68、H460SM-71的增殖指数PI低于对照组细胞H460SM-NS,说明干扰整合素β4的表达可能抑制非小细胞肺癌细胞的增殖。结论：1.成功构建a6、β4 shRNA稳定表达的非小细胞肺癌细胞株。2.抑制β4整合素的表达可能抑制非小细胞肺癌细胞的增殖。3.抑制a6、B4整合素的表达,可能不影响非小细胞肺癌细胞的凋亡。4.β4 shRNA稳定表达的非小细胞肺癌细胞增殖可能受到抑制,考虑与细胞周期调控有关。
穆昱,陈艳,王熙才[9]（2011）在《整合素与肺癌》文中进行了进一步梳理0引言《全国第三次死因回顾抽样调查报告》显示,肺癌已居我国恶性肿瘤死亡原因之首位。目前,综合治疗方案已使疗效有所提高,但5年生存率仍不足20%。其主要原因是肺癌的侵袭与转移。近年来研
孟盈盈,李春红[10]（2009）在《整合素β-1对绒毛膜癌细胞耐药的影响》文中进行了进一步梳理目的:探讨耐药绒毛膜癌细胞粘附分子β-1整合素的表达以及其对细胞凋亡的影响,并寻找逆转耐药的途径。方法:采用人绒毛膜癌细胞株JER及耐足叶乙甙细胞株JEG,免疫组化方法检测绒癌细胞和耐药细胞β-1整合素的表达;MTT法、TUNEL法检测其对细胞凋亡的影响。结果:敏感细胞JER、耐药细胞JEG中均有β-1整合素的表达,但耐药细胞的β-1整合素表达总体水平高于敏感细胞（P<0.01）;在敏感细胞及耐药细胞中加入纤维粘连蛋白FN其凋亡率与未结合FN的细胞相比有明显差异（P<0.01）;在敏感细胞及耐药细胞中加入抗β-1整合素抗体阻断细胞与β-1整合素的结合,同时加入纤维粘连蛋白FN,其凋亡率与只加入FN时相比差异有显着性（P<0.01）。结论:耐药绒癌细胞β-1整合素表达增加,成为耐药表型;其机制主要通过抑制细胞凋亡产生耐药;阻断其作用可以逆转肿瘤耐药。
二、β_1整合素及纤维粘连蛋白与肺癌细胞凋亡关系的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、β_1整合素及纤维粘连蛋白与肺癌细胞凋亡关系的实验研究（论文提纲范文）
（1）针刀干预对颈椎间盘退变兔整合素α5、β1和Fn影响的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 理论研究 |
| 一 祖国医学对颈椎病的认识 |
| 1 颈椎病病因探讨 |
| 2 颈椎病的中医发病机制 |
| 3 中医治疗颈型颈椎病的研究进展 |
| 二 现代医学对颈椎病的认识 |
| 1 现代医学对颈椎病致病因素的认识 |
| 2 发病机制 |
| 3 颈椎病的西医治疗 |
| 三 椎间盘力学因素的改变在颈椎间盘退变过程中的重要作用 |
| 实验研究 |
| 实验一: 颈椎间盘退变兔的模型制备 |
| 一、实验方法 |
| 1 实验动物 |
| 2 实验仪器与设备 |
| 3 实验模型制备 |
| 二、实验结果 |
| 1 一般情况 |
| 2 MRI影像学观察 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 实验二: 针刀干预对颈椎间盘退变兔颈部肌肉组织形态学、整合素α5、β1、Fn及IL-6表达的影响 |
| 一、实验方法 |
| 1 实验动物 |
| 2 实验仪器设备 |
| 3 实验试剂 |
| 4 模型制备 |
| 5 动物分组及干预 |
| 6 取材方法 |
| 7 检测方法 |
| 8 统计分析 |
| 二、实验结果 |
| 1 一般情况 |
| 2 HE染色结果 |
| 3 椎间盘髓核中整合素α5、β1、Fn蛋白含量变化 |
| 4 椎间盘髓核中整合素α5、β1、Fn mRNA相对表达量变化 |
| 5 血液中IL-6含量变化 |
| 三、讨论 |
| 1.实验指标的选择意义 |
| 2.实验结果讨论 |
| 问题与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）埃克替尼耐药的非小细胞肺癌转移的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 Integrinα5 通过FAK/STAT3/AKT通路促进埃克替尼耐药NSCLC转移 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养及耐药细胞系的建立 |
| 2.2.2 MTT检测细胞活力 |
| 2.2.3 集落形成实验 |
| 2.2.4 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力 |
| 2.2.5 划痕实验 |
| 2.2.6 全转录组测序和生物信息学分析 |
| 2.2.7 siRNA转染 |
| 2.2.8 Western blot检测蛋白水平 |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 埃克替尼耐药细胞系PC9/IcoR和 827/IcoR对埃克替尼耐药 |
| 3.2 埃克替尼耐药细胞迁移及侵袭能力比亲本细胞增强 |
| 3.3 integrinα5 在埃克替尼耐药细胞中表达显着高于亲本细胞 |
| 3.4 integrinα5 促进埃克替尼耐药细胞的迁移和耐药 |
| 3.5 integrinα5 通过FAK/STAT3/AKT通路促进埃克替尼耐药细胞的迁移 |
| 3.6 AKT活化促进埃克替尼耐药细胞的迁移 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:基于整合素家族筛选并构建特异性影响肺腺癌预后的3-整合素预测模型 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 癌症和肿瘤基因图谱数据集下载与处理 |
| 2.1.1 癌症和肿瘤基因图谱肺腺癌数据集的下载 |
| 2.1.2 数据整合及处理 |
| 2.2 生存分析及构建肺腺癌特异性整合素预后模型 |
| 2.2.1 COX比例风险回归分析筛选肺癌预后相关整合素分子 |
| 2.2.2 多因素COX回归构建肺腺癌整合素特征预后模型 |
| 2.2.3 整合素生存预测模型的评估及评价效能预测 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 整合素家族基因表达情况及COX回归分析筛选预后相关分子 |
| 3.2 构建肺腺癌特异性的整合素3-基因预后预测模型 |
| 3.3 肺腺癌特异性的整合素3-基因模型作为预后预测模型的评估及应用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 EGFR-TKI耐药的非小细胞肺癌转移机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）缺血性中风恢复期证素关联分析及健脾补土方对体外神经元低氧损伤后凋亡的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 abstract 英文缩略词表 引言 第一部分 基于文献对缺血性脑中风恢复期证素的关联分析 |
| 1 资料与方法 |
| 1.1 资料来源 |
| 1.2 纳入标准 |
| 1.3 排除标准 |
| 1.4 筛选方法 |
| 1.5 数据录入与处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 证素病性关联分析 |
| 2.2 证素病位关联分析 |
| 3 讨论 第二部分 健脾补土法组方对体外神经元低氧损伤凋亡后Bax、Bcl-2、MEK、Erk2表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 中药 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 中药制备 |
| 2.2 含药血清制备 |
| 2.3 原代神经元分离及培养 |
| 2.4 细胞化学染色鉴定细胞 |
| 2.5 含药血清的合理化浓度摸索 |
| 2.6 分组与造模 |
| 2.7 指标检测 |
| 2.7.1 流式细胞术检测各组神经细胞凋亡的情况 |
| 2.7.2 RT-PCR法检测Bax、Bcl-2、MEK、Erk2 mRNA的表达 |
| 2.7.3 Western-blotting法和免疫细胞化学法检测Bax、Bcl-2、MEK、Erk2蛋白的表达 |
| 3 统计学处理 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 健脾补土方对各处理组神经细胞凋亡的影响 |
| 4.2 健脾补土方对神经元细胞Bax、Bcl-2、MEK、Erk2 mRNA表达的影响 |
| 4.3 健脾补土组方对神经元细胞Bax、Bcl-2、MEK、Erk2蛋白表达的影响 第三部分 讨论 |
| 1 脑缺血损伤与细胞失巢凋亡的关系 |
| 1.1 脑缺血损伤 |
| 1.2 神经细胞失巢凋亡 |
| 1.3 INT/FAK信号通路与神经细胞外ECM的关系 |
| 1.4 Bax、Bcl-2、MEK、Erk2在缺血性脑中风中的作用 |
| 1.4.1 Bax/Bcl-2与细胞凋亡的关系 |
| 1.4.2 Raf/MEK/ERK信号通路与细胞凋亡的关系 |
| 2.健脾补土组方抗神经细胞凋亡的机理探讨 |
| 2.1 缺血性中风病因病机的认识 |
| 2.2 “脾土”与ECM的类似点 |
| 2.3 健脾补土方方解及中药的作用 |
| 3.健脾补土方抗神经细胞凋亡实验研究进展 第四部分 结论 参考文献 致谢 附录 |
| 附录一 图片 |
| 附录二 综述 |
| 参考文献 |
| 附录三 硕士期间科研及获奖情况 |
（4）miR-338在肺癌中的表达及其通过靶向作用于整合素β3抑制肺癌转移的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 第一部分 miR-338在肺癌细胞株及肺癌组织中的表达及意义 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 上调miR-338表达对肺癌细胞株A549、NCI-H292生物学行为的影响 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 miR-338通过靶向作用于整合素 β3 抑制肺癌转移 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 综述一 microRNAs与肺癌的发生、发展与预后的研究 |
| 参考文献 |
| 综述二 整合素信号通路在肿瘤以及肺癌发生、发展和治疗中的作用 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 博士期间发表文章 |
| 致谢 |
（5）siRNA沉默CLIC1基因对人胃癌细胞生物学行为的影响及相关机制的体外研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 siRNA CLIC1重组慢病毒载体及低表达CLIC1稳转胃癌细胞株的构建及鉴定 |
| 材料与方法 |
| 1. 主要材料 |
| 2. 主要试剂及仪器设备 |
| 3. 实验用主要液体的配制 |
| 4. 实验方法 |
| 5. 统计学方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第二部分 siRNA沉默CLIC1基因表达后对胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 材料与方法 |
| 1. 主要试剂 |
| 2. 主要仪器设备 |
| 3. 实验用主要液体的配制 |
| 4. 实验方法 |
| 5. 统计学方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第三部分 基于iTRAQ的蛋白组学技术筛选抑制CLIC1表达前后胃癌细胞SGC-7901中的差异表达蛋白 |
| 材料与方法 |
| 1. 主要试剂 |
| 2. 主要仪器设备 |
| 3. 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第四部分 siRNA抑制CLIC1基因表达后对胃癌细胞凋亡和整合素基因及蛋白的影响 |
| 材料与方法 |
| 1. 主要试剂 |
| 2. 主要仪器设备 |
| 3. 实验用主要液体的配制 |
| 4. 实验方法 |
| 6. 统计学方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 附件 |
（6）中华真地鳖（Eupolyphaga sinensis）抗肿瘤蛋白分离纯化及其体外抗转移活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 前言 |
| 1 抗肿瘤药物研发战略 |
| 1.1 新的细胞毒类药物 |
| 1.2 新靶点抗肿瘤药物研究 |
| 2 整合素与肿瘤转移 |
| 2.1 整合素结构 |
| 2.2 整合素在肿瘤转移过程中的作用 |
| 2.2.1 整合素对细胞存活的作用 |
| 2.2.2 整合素对细胞迁移的影响 |
| 2.2.3 整合素调节血管生成 |
| 2.2.4 整合素对肿瘤入侵与转移的影响 |
| 2.2.5 ECM—整合素相互作用成为癌症治疗的重要靶点 |
| 2.2.5.1 整合素抑制剂 |
| 2.2.5.2 基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂 |
| 3 动物毒素的抗肿瘤作用 |
| 3.1 斑蝥素(cantharidin,CA) |
| 3.2 多肽、蛋白质或酶类 |
| 3.2.1 蛇毒素去整合素(Disintegrins) |
| 3.2.2 蝎毒素Chlorotoxin(Cltx) |
| 3.2.3 蜂毒素(Melittin) |
| 3.2.4 海鞘多肽Didemnin B |
| 3.2.5 海兔多肽Dolastatin |
| 3.2.6 海兔蛋白Cyplasin |
| 4 中华真地鳖化学成分及药理作用研究进展 |
| 4.1 中华真地鳖活性成分 |
| 4.1.1 蛋白质(酶)和氨基酸 |
| 4.1.1.1 氨基酸 |
| 4.1.1.2 纤溶活性成分 |
| 4.1.1.3 抗肿瘤活性蛋白成分 |
| 4.1.2 脂肪酸 |
| 4.1.3 生物碱 |
| 4.1.4 脂溶性维生素和无机元素 |
| 4.1.5 高级醇及其衍生物 |
| 4.1.6 其他成分 |
| 4.2 中华真地鳖的药理作用 |
| 4.2.1 对心血管系统的影响 |
| 4.2.1.1 抗凝血和抗血栓作用 |
| 4.2.1.2 调节血脂、抗氧自由基及保护血管内皮细胞的作用 |
| 4.2.1.3 对血液流变性作用 |
| 4.2.1.4 抗缺血缺氧 |
| 4.2.2 抑制血管生成及抗肿瘤活性 |
| 4.2.3 抗突变作用 |
| 4.2.4 治疗骨折创伤作用 |
| 4.2.5 对免疫系统的影响及抗氧化作用 |
| 4.2.6 其他作用 |
| 5 本课题研究的目的和意义 |
| 第二章 中华真地鳖抗肿瘤蛋白分离纯化及鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验材料及细胞 |
| 1.2 主要仪器设备及耗材 |
| 1.3 酶及主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 中华真地鳖抗肿瘤蛋白的分离纯化 |
| 2.1.1 蛋白粗提物的制备 |
| 2.1.2 抗肿瘤蛋白的纯化 |
| 2.1.2.1 CM-Sepharose FF弱阳离子交换色谱 |
| 2.1.2.2 DEAE-Sepharose FF弱阴离子交换色谱 |
| 2.1.2.3 Q-Sepharose HP强阴离子交换色谱 |
| 2.1.2.4 Butyl Sepharose HP疏水相互作用色谱 |
| 2.1.2.5 Superdex 75凝胶过滤色谱 |
| 2.1.3 中华真地鳖抗肿瘤蛋白提取纯化流程 |
| 2.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 2.3 细胞培养 |
| 2.4 MTT法检测蛋白组分体外抗肿瘤活性 |
| 2.5 中华真地鳖抗肿瘤蛋白鉴定 |
| 2.5.1 SDS-PAGE鉴定蛋白纯度和表观分子量 |
| 2.5.2 质谱法测定分子质量 |
| 2.6 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 中华真地鳖抗肿瘤蛋白的分离纯化 |
| 3.1.1 CM-Sepharose FF阳离子交换色谱结果 |
| 3.1.2 DEAE-Sepharose FF阴离子交换色谱结果 |
| 3.1.3 Q-Sepharose HP阴离子交换色谱结果 |
| 3.1.4 Butyl SepharoseHP疏水色谱结果 |
| 3.1.5 Superdex 75凝胶过滤色谱结果 |
| 3.2 中华真地鳖抗肿瘤蛋白鉴定 |
| 3.2.1 SDS-PAGE结果 |
| 3.2.2 MALDI-TOF-MS结果 |
| 3.3 中华真地鳖抗肿瘤蛋白得率 |
| 3.4 分离纯化过程中各活性组分体外抗肿瘤活性检测 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第三章 中华真地鳖抗肿瘤蛋白EPS72体外抗肿瘤方式研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 主要仪器设备及耗材 |
| 1.3 酶及主要试剂 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 MTT存活分析 |
| 2.2.1 EPS72抗瘤谱分析 |
| 2.2.2 EPS72对A549细胞增殖的影响 |
| 2.3 细胞形态学观察 |
| 2.4 台盼蓝染色计数 |
| 2.5 JC-1检测线粒体膜电位(△Ψm) |
| 2.6 AO/EB双荧光染色 |
| 2.7 细胞—基质粘附实验 |
| 2.8 细胞伸展实验 |
| 2.9 细胞迁移实验 |
| 2.10 细胞侵袭实验 |
| 2.11 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 EPS72对体外培养肿瘤细胞及正常细胞的胞毒作用 |
| 3.2 EPS72对A549细胞增殖与存活的影响 |
| 3.3 EPS72对A549细胞形态学的影响 |
| 3.4 脱粘附细胞存活状态检测 |
| 3.4.1 台盼蓝染色结果 |
| 3.4.2 撤药重培养结果 |
| 3.5 EPS72进一步诱导A549细胞凋亡 |
| 3.5.1 JC-1检测线粒体膜电位(△Ψm)结果 |
| 3.5.2 AO/EB荧光染色结果 |
| 3.6 EPS72对A549细胞粘附的影响 |
| 3.7 EPS72对A549细胞伸展能力的影响 |
| 3.8 EPS72对肿瘤细胞迁移能力的影响 |
| 3.9 EPS72对肿瘤细胞侵袭能力的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第四章 中华真地鳖抗肿瘤蛋白EPS72体外抗肿瘤作用分子机制的初步研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 主要仪器设备及耗材 |
| 1.3 酶及主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 微丝F-actin免疫荧光染色 |
| 2.2 流式细胞仪检测β1-整合素的表面表达 |
| 2.3 Western blotting分析β1-整合素和ILK细胞内表达情况 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 EPS72诱导F-actin解聚 |
| 3.2 EPS72影响β1-整合素和ILK表达 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 总结与展望 |
| 1 本研究的主要结论 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| Article |
| 致谢 |
| 博士期间发表的论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（7）整合素β1表达上调对非小细胞肺癌EGFR TKI耐药的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 Abstract 第1章 |
| 引言 1.1 |
| 概述 1.2 |
| 表皮生长因子受体抑制剂耐药的机制 1.3 |
| 整合素家族 1.4 |
| 课题的研究目的，理论意义和实际运用价值 1.5 |
| 课题前期实验工作 1.6 |
| 实验技术路线 第2章 |
| 整合素β1 |
| 表达上调对吉非替尼抑制细胞增殖的影响 2.1 |
| 实验材料 2.2 |
| 实验方法 2.3 |
| 结果 2.4 |
| 讨论 2.5 |
| 小结 第3章 |
| 整合素β1 |
| 表达上调对吉非替尼抑制肿瘤生长的影响 3.1 |
| 实验材料 3.2 |
| 实验方法 3.3 |
| 结果 3.4 |
| 讨论 3.5 |
| 小结 第4章 |
| 移植瘤形态学检查及其组织中整合素β1、EGFR、pEGFR |
| 的表达情况 4.1 |
| 实验材料 4.2 |
| 实验方法 4.3 |
| 结果 4.4 |
| 讨论 4.5 |
| 小结 第5章 |
| 结论与展望 5.1 |
| 结论 5.2 |
| 进一步工作的方向 参考文献 综述 参考文献 中英文缩写列表 致谢 |
（8）整合素α6β4在非小细胞肺癌生长中的作用研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参与科研工作情况 |
| 致谢 |
（9）整合素与肺癌（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 整合素及其信号转导 |
| 1.1 整合素的结构和功能 |
| 1.2 整合素的信号转导 |
| 2 整合素在肺癌细胞黏附中的作用 |
| 2.1 肺癌细胞之间的黏附 |
| 2.2 肺癌细胞与ECM之间的黏附 |
| 3 整合素在肺癌侵袭转移中的作用 |
| 4 整合素在肺癌细胞凋亡中的作用 |
| 5 整合素在肺癌血管生成中的作用 |
| 6 整合素在肺癌中的表达与临床意义 |
| 7 问题与展望 |
（10）整合素β-1对绒毛膜癌细胞耐药的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 生长曲线测定 |
| 1.2.2 免疫组化检测粘附分β-1整合素的表达 |
| 1.2.2.1 实验分组: |
| 1.2.2.2 细胞涂片的制备及处理 |
| 1.3 处理方法 |
| 1.4 MTT法检测β1整合素及其配体FN对绒癌细胞凋亡中的影响: |
| 1.4.1 细胞悬液的制备及处理 |
| 1.4.2 MTT比色分析 |
| 1.5 Tunnel法检测细胞凋亡 |
| 1.6 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 生长曲线 |
| 2.2 免疫组化法 |
| 2.3 MTT检测细胞凋亡 |
| 2.4 Tunnel法检测细胞凋亡 |
| 3 讨论 |
四、β_1整合素及纤维粘连蛋白与肺癌细胞凋亡关系的实验研究（论文参考文献）
- [1]针刀干预对颈椎间盘退变兔整合素α5、β1和Fn影响的实验研究[D]. 宋子琪. 南京中医药大学, 2021(02)
- [2]埃克替尼耐药的非小细胞肺癌转移的机制研究[D]. 杨旸. 中国医科大学, 2021(02)
- [3]缺血性中风恢复期证素关联分析及健脾补土方对体外神经元低氧损伤后凋亡的影响[D]. 张婕. 湖南中医药大学, 2018(01)
- [4]miR-338在肺癌中的表达及其通过靶向作用于整合素β3抑制肺癌转移的研究[D]. 陈晓. 郑州大学, 2016(03)
- [5]siRNA沉默CLIC1基因对人胃癌细胞生物学行为的影响及相关机制的体外研究[D]. 刘金禄. 广西医科大学, 2015(08)
- [6]中华真地鳖（Eupolyphaga sinensis）抗肿瘤蛋白分离纯化及其体外抗转移活性研究[D]. 王凤霞. 山东大学, 2013(04)
- [7]整合素β1表达上调对非小细胞肺癌EGFR TKI耐药的影响[D]. 张学兰. 苏州大学, 2011(06)
- [8]整合素α6β4在非小细胞肺癌生长中的作用研究[D]. 穆昱. 昆明医学院, 2011(10)
- [9]整合素与肺癌[J]. 穆昱,陈艳,王熙才. 肿瘤防治研究, 2011(03)
- [10]整合素β-1对绒毛膜癌细胞耐药的影响[J]. 孟盈盈,李春红. 航空航天医药, 2009(09)