一、维生素A从循环向组织转运存在多种途径（论文文献综述）
贺思诺[1]（2021）在《基于TLR4/NF-κB通路探讨SDR9C7基因在急性肺损伤模型中作用机制》文中提出研究目的:为研究急性肺损伤模型小鼠肺组织Sdr9c7基因在急性肺损伤中的作用,我们利用脂多糖诱导C57BL/6小鼠（SPF级）建立急性肺损伤模型,检测了急性肺损伤模型小鼠肺组织Sdr9c7基因、炎症因子及TLR4/NF-κB通路表达差异。利用A549细胞验证敲低SDR9C7基因表达对炎症因子及TLR4/NF-κB通路表达的影响,初步探讨它们之间的联系及作用机制,为阐明SDR9C7参与急性肺损伤发病机制提供一定参考。研究方法:选取9只雌性C57BL/6小鼠随机分为空白组、第3天组和第7天组,每组3只。第3天组和第7天组小鼠用LPS诱导急性肺损伤模型,第3天组于LPS诱导的第3天终止实验,第7天组于LPS诱导的第7天终止实验,空白组经鼻腔滴注PBS溶液作对照实验。采用HE染色观察小鼠肺组织形态学,并评估病理评分;用Western Blot检测肺组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白相对表达量;用RT-qPCR检测肺组织IL-1β、TNF-a、IL-6和SDR9C7基因相对表达量。利用A549细胞转染SDR9C7-siRNA,RT-qPCR检测SDR9C7基因相对表达量,验证SDR9C7-siRNA敲低SDR9C7基因表达的效果。SDR9C7-siRNA转染A549细胞为敲低组,脂多糖诱导A549细胞为诱导组,SDR9C7-siRNA转染和脂多糖诱导A549细胞分联合组,设立对照组,采用Western Blot检测A549细胞TLR4、MyD88、NF-κB蛋白相对表达量;用RT-qPCR检测A549细胞IL-1β、TNF-a、IL-6和SDR9C7基因相对表达量。研究结果:（1）HE染色结果显示,LPS诱导的ALI模型小鼠表现出明显的病理损伤,与空白组比较,第3天组和第7天组肺水肿评分、炎症评分以及总病理评分升高;与第3天组比较,第7天组炎症评分和总病理评分降低,差异均有统计学意义（均P<0.05）。（2）与空白组比较,第3天组和第7天组TLR4、MyD88、NF-κB蛋白相对表达量均明显升高,且第3天组高于第7天组,差异均有统计学意义（均P<0.01）。（3）与空白组比较,第3天组和第7天组SDR9C7、IL-1β、TNF-a和IL-6基因相对表达量均明显升高,第3天组SDR9C7、IL-1β、TNF-a基因相对表达量高于第7天组,第3天组IL-6基因相对表达量低于第7天组,差异均有统计学意义（均P<0.01）。（4）小鼠肺组织SDR9C7基因相对表达量与病理评分呈正相关（r=0.964,P<0.01）。（5）SDR9C7基因表达在空白对照、SDR9C7-siRNA1、SDR9C7-siRNA2和SDR9C7-siRNA3中依次降低,SDR9C7-siRNA3敲低SDR9C7基因表达效果更明显。（6）与对照组比较,诱导组TLR4、MyD88、NF-κB蛋白相对表达量升高（均P<0.05）,敲低组和联合组TLR4、MyD88、NF-κB蛋白相对表达量下降（均P<0.05）,且敲低组低于联合组（均P<0.05）。（7）与对照组比较,诱导组IL-1β、TNF-a、IL-6、SDR9C7基因相对表达量升高（均P<0.05）,敲低组和联合组IL-1β、TNF-a、IL-6、SDR9C7基因相对表达量下降（均P<0.05）,且敲低组低于联合组（均P<0.05）。结论:本研究发现ALI模型小鼠肺组织SDR9C7基因、炎症因子及TLR4/NF-κB通路异常表达,SDR9C7-siRNA3有效敲低A549细胞SDR9C7基因表达,降低IL-1β、TNF-a、IL-6基因及TLR4/NF-κB通路的表达。LPS诱导小鼠ALI机制可能与SDR9C7基因高表达促进炎症反应作用及活化TLR4/NF-κB通路相关。
冯佳宾[2]（2021）在《超重、肥胖儿童血清微量营养素水平分析》文中研究指明目的儿童、青少年超重、肥胖已成为全球重大公共卫生问题且超重率、肥胖率居高不下,本研究通过了解健康儿童及超重、肥胖儿童血清微量营养素、生化指标酶水平,探讨其与超重、肥胖的关系,为针对性营养指导提供科学依据。方法选取资料完整的2018年9月2020年9月就诊于沈阳市儿童医院儿童保健门诊、青春发育门诊并符合纳入标准及排除标准的的超重/肥胖儿童191例,根据BMI百分位数分为超重组（n=67）、肥胖组（n=71）、极度肥胖组（n=53）,同时选取儿童保健门诊就诊的健康儿童（n=63）作为对照组。收集各组患儿一般资料及外周血血清微量营养素、生化指标酶水平。运用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。结果1.超重组、肥胖组、极度肥胖组、对照组四组间性别、体重间比较差异有统计学意义（P<0.05）,年龄、身高间比较差异无统计学意义（P>0.05）。2.对照组、超重组、肥胖组、极度肥胖组四组间外周血血清Ca、Mg、Fe、Co、Hg、Ni、25-OH-D、25-OH-D3、ALP、ALT、AST、GGT、CHE、LDH、CK、αHBDH水平比较差异具有统计学意义（P<0.05）,血清Cu、Se、Zn、Li、Mn、Pb、Cd、VA、25-OH-D2、CKMB水平在四组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。3.Spearman相关性分析表明外周血血清Ca、Mg、Fe、Co、Ni、25-OH-D、25-OH-D3水平与BMI值呈负相关（r=-0.669,-0.178,-0.244,-0.169,-0.129,-0.454,-0.458）,年龄、Hg、ALP、ALT、AST、GGT、CHE、LDH、Ck、a HBDH水平与BMI值呈正相关（r=0.230,0.183,0.441,0.367,0.475,0.351,0.403,0.489,0.417,0.473）,差异具有统计学意义（P<0.05）。进一步矫正Mg、Co、Ni、25-OH-D、25-OH-D3、ALP等混杂因素后证实,外周血血清Ca（r=-0.461）、Fe（r=-0.241）、25-OH-D3（r=-0.128）水平与BMI仍然呈负相关,年龄（r=0.375）、GGT（r=0.203）与BMI仍然呈正相关,差异有统计学意义（P<0.05）。4.以非肥胖组（包括对照组、超重组）和肥胖组（包括肥胖组、极度肥胖组）分组,对单因素分析中有统计学意义的影响因素建立多因素二元Logistic回归模型结果显示,低Ca（OR=0.655,95%CI:0.5250.817）、低Mg（OR=0.636,95%CI:0.4410.916）、低Fe（OR=0.025,95%CI:0.0030.200）、高ALT（OR=0.953,95%CI:0.9210.987）、高体重（OR=1.226,95%CI:1.1321.327）是肥胖发生可能的危险因素,两组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论1.男童较女童更容易出现超重/肥胖现象,相对于健康儿童,极度肥胖儿童身高值更高。2.与健康儿童比较,超重/肥胖儿童外周血血清Ca、Mg、Fe、Co、Ni、25-OH-D、25-OH-D3水平偏低,血清Hg、ALP、ALT、AST、GGT、CHE、LDH、CK、αHBDH水平偏高。3.外周血血清Ca、Fe、25-OH-D3水平与BMI值呈负相关,年龄、GGT与BMI值呈正相关。4.低Ca、低Mg、低Fe、高ALT、高体重水平是肥胖发生可能的危险因素。5.外周血血清微量营养素、酶水平与儿童超重、肥胖发生密切相关,应重视儿童家长适时监测及合理膳食意识。
郭颖[3]（2020）在《抑制自噬诱导肿瘤相关巨噬细胞复极化和增强喉癌细胞对顺铂的化学敏感性》文中进行了进一步梳理研究背景:肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是肿瘤微环境中的主要细胞组成部分和关键调控者,TAMs参与喉癌等肿瘤的生长,血管生成和淋巴管生成,肿瘤侵袭,转移和免疫抑制等过程。在过去的十年中,研究发现TAMs也可以促进化疗耐药性。化疗药物诸如紫杉醇和顺铂可以损伤肿瘤细胞有丝分裂过程并诱导肿瘤细胞凋亡。肿瘤细胞的死亡将刺激TAMs扩增并募集其循环前体细胞,而增殖的TAMs将分泌细胞因子以促进肿瘤干细胞的增殖和抑制肿瘤细胞凋亡。研究表明,在结肠癌,胰腺癌和乳腺癌中,靶向TAMs可以抑制肿瘤进展并提高化疗效果。巨噬细胞是具有高度表型分化和功能异质性的免疫细胞,根据巨噬细胞活化后的不同表型,主要分为两个亚型,即1型巨噬细胞（M1）和2型巨噬细胞（M2）。M1和M2作为被彻底极化的活化巨噬细胞,是两个对立的极端状态,M1巨噬细胞是处于“经典的”活化状态,具有促炎和抑肿瘤的作用;而M2巨噬细胞是处于“可选择性”活化状态,具有抗炎和促肿瘤作用。肿瘤组织中巨噬细胞亚型的组成决定了 TAMs是抑肿瘤还是促肿瘤。在许多癌症类型中,M2巨噬细胞在TAMs中占主导地位,TAMs主要起着促进肿瘤的作用。因此,将TAMs从促肿瘤的M2重新极化为抗肿瘤的M1是一种非常有潜力的癌症治疗策略。自噬是一个将细胞中多余的或具有潜在毒性的物质包裹进入自噬小体,并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物的过程。自噬在真核细胞中高度保守,参与调节细胞代谢和某些细胞器的更新。在巨噬细胞中,自噬不仅参与细胞内质量控制和代谢过程,对于细胞分化和重塑也至关重要。自噬可调控单核细胞的细胞发育,从而干扰巨噬细胞的分化。越来越多的证据表明巨噬细胞是连接自噬和机体免疫的桥梁之一。有研究报道,自噬水平的下调限制了 M2巨噬细胞的分化。因此,我们推测抑制自噬可以使TAMs从M2表型复极化为M1表型。首先我们发现自噬抑制剂氯喹（CQ）可以在体外使M2巨噬细胞复极化为M1表型,然后经检测发现重新极化后的巨噬细胞对人喉癌Hep-2细胞具有更高的吞噬活性,并且恢复了Hep-2细胞对顺铂（CDDP）的敏感性。最后,我们评估了 CQ在体内的治疗效果,结果表明,CQ可以在小鼠体内抑制Hep-2肿瘤细胞的生长并增强CDDP对肿瘤的治疗效果,在此过程中TAMs在CQ的诱导下重新极化为M1表型。研究目的:探究自噬抑制剂CQ是否可诱导M2巨噬细胞复极化为M1表型及CQ诱导的巨噬细胞复极化在体外和体内抑制喉癌细胞生长的机制。研究方法:1.诱导体外巨噬细胞极化从C57BL/6小鼠中分离出处于M0状态的骨髓衍生的巨噬细胞（BMDMs）,并在IFN-丫和LPS条件下诱导BMDMs向M1表型极化,在IL-4条件下诱导巨噬细胞向M2表型极化。利用qRT-PCR检测极化后的巨噬细胞中精氨酸酶1（Arg1）,甘露糖受体1（Mrc1）,白介素-12（IL-12）和一氧化氮合酶（NOS2）的基因转录水平来评估巨噬细胞极化表型。2.证明自噬抑制剂CQ是否可以诱导体外M2巨噬细胞复极化为M1表型基于细胞中LC3-Ⅱ的表达水平与细胞自噬活性呈正相关,于是我们通过WB来检测不同表型巨噬细胞中的LC3-Ⅱ蛋白表达水平,从而比较不同表型巨噬细胞的自噬活性。接下来,探究抑制M2巨噬细胞的自噬活性是否会促使M2巨噬细胞再极化为M1表型,在M2巨噬细胞培养液中加入自噬抑制剂CQ处理24小时,对照组用PBS处理。然后利用qRT-PCR和WB分别检测CQ处理组和对照组中Arg1,Mrc1,IL-12,NOS2的RNA和蛋白表达水平,为了进一步验证巨噬细胞的复极化,我们使用流式细胞术（FACS）分别分析表达CD206（M2 marker）和 MHCⅡ（M1 marker）的细胞群。3.评估M2巨噬细胞复极化对巨噬细胞吞噬作用的影响,以及是否影响人喉癌细胞系Hep-2对CDDP的药物敏感性使用人喉癌细胞系Hep-2来检测复极化后的M2巨噬细胞的抗肿瘤活性。首先评估M2至M1复极化是否增强了吞噬作用对肿瘤细胞的直接杀伤力。使用CQ预处理以诱导M2巨噬细胞复极化,将复极化后的巨噬细胞与GFP标记的细胞系Hep-2共培养24小时,使用FACS检测与巨噬细胞标记物F4/80抗体同时出现的GFP信号,两种信号的并发则表示巨噬细胞对Hep-2-GFP细胞的吞噬行为。接着评估M2至M1复极化是否可以增强化疗效果,将经CQ处理的M2巨噬细胞和经PBS处理的M2巨噬细胞预培养24小时,然后分别收集条件培养基用来培养Hep-2,再将化疗药物CDDP添加到培养基中,孵育48小时后使用膜联蛋白V/碘化丙啶凋亡测定法检测Hep-2的细胞凋亡水平。另外,通过MTT实验检测了 CQ对体外Hep-2细胞活力的影响。4.探究CDDP,CQ以及CQ/CDDP联合治疗在体内的抗肿瘤活性建立了人喉癌细胞系Hep-2在小鼠体内荷瘤实验模型,将人喉癌细胞系Hep-2皮下注射到nu/nu小鼠右后方的皮肤下,当肿瘤大小达到50mm3,每三天给予CDDP,CQ,CDDP+CQ或对照PBS治疗,共给予治疗五次。计算各组肿瘤的平均体积和平均重量来绘制肿瘤生长曲线。然后使用PCNA测定法检测肿瘤组织切片中的Hep-2细胞增殖情况,使用TUNEL测定法检测肿瘤组织切片中的细胞凋亡情况。5.探究CQ是否通过抑制自噬以及诱导TAMs复极化而影响体内肿瘤生长通过Western Blot实验检测脂化微管相关蛋白1轻链3（LC3-Ⅱ）的表达水平来表征肿瘤组织中的自噬活性。通过流式细胞仪检测经过PBS,CQ,CDDP,CQ+CDDP四种不同治疗后的肿瘤组织中的CD11b+F4/80+CD206+M2表型巨噬细胞和CD1 1b+F4/80+MHCⅡ+M1表型巨噬细胞。研究结果:1.M1和M2巨噬细胞体外极化Arg1和Mrc1是表征M2巨噬细胞的特征基因,而IL-12和NOS2是表征M1巨噬细胞的特征基因。qRT-PCR结果表明,经IL-4诱导的巨噬细胞中Arg1和Mrc1的RNA表达水平均明显高于LPS/IFN-γ诱导组（P<0.0001****）;相反地,经IL-4诱导的巨噬细胞中IL-12和NOS2的RNA表达水平均明显低于LPS/IFN-γ诱导组（P<0.0001****）。这些结果说明,LPS/IFN-γ成功诱导了 BMDMs向M1表型极化,IL-4成功诱导了 BMDMs向M2表型极化。2.自噬抑制剂CQ在体外诱导M2巨噬细胞复极化为M1表型WB光密度分析结果表明M2巨噬细胞中LC3-Ⅱ蛋白表达水平明显高于M1巨噬细胞（P<0.001***）。qRT-PCR和WB结果都表明,经CQ处理的M2巨噬细胞中ARG1,MRC1的蛋白表达水平明显低于对照组,而IL-12和NOS2的蛋白表达水平明显高于对照组。流式结果表明,经CQ处理后的M2巨噬细胞表面CD206水平明显低于对照组,而MHCⅡ水平明显上调。综上可知,CQ诱导了M2巨噬细胞重新极化为M1巨噬细胞。3.M2至M1复极化可增强巨噬细胞的吞噬作用并增加肿瘤细胞对CDDP的敏感性体外吞噬实验结果表明,经CQ处理的M2巨噬细胞中的GFP信号强度明显高于对照组,说明CQ处理诱导的M2至M1的复极化显着增强了巨噬细胞对人喉癌Hep-2细胞的吞噬作用。膜联蛋白V/碘化丙啶凋亡实验结果表明,M2巨噬细胞降低了 Hep-2细胞对CDDP的敏感性,导致顺铂处理时Hep-2细胞凋亡水平明显下调,但M2到M1的复极化恢复了 Hep-2细胞对CDDP的敏感性,增加了顺铂处理时Hep-2细胞的凋亡水平。4.CDDP,CQ和CQ/CDDP联合疗法在体内的抗肿瘤活性与对照组相比,CQ处理显着抑制了肿瘤体积和重量。与CDDP处理组相比,CQ/CDDP联合处理具有更好的肿瘤抑制效果。PCNA定量分析结果表明,CQ/CDDP联合处理组中PCNA 阳性细胞所占比例明显减少,这表明CQ/CDDP联合处理可更有效地抑制Hep-2细胞增殖。TUNEL定量分析结果表明,CQ/CDDP处理组中TUNEL阳性细胞所占比例明显增多,这表明CQ/CDDP联合处理可以显着促进Hep-2细胞凋亡。综合以上结果表明,CQ具有在体内抑制肿瘤生长和提高CDDP治疗效果的作用。5.CQ抑制Hep-2肿瘤中的细胞自噬并使TAMs复极化为M1表型与对照组相比,CQ处理组及CQ/CDDP联合处理组肿瘤组织中LC3-Ⅱ水平都显着增加（P<0.001***）;CDDP处理组与对照组相比,LC3-Ⅱ水平无显着性差异。流式分析结果表明,CQ处理使肿瘤组织中M2巨噬细胞所占细胞百分比降低了50%以上（CQ:P<0.005**;CQ+CDDP:P<0.001***）,M1巨噬细胞所占百分比增加了 200%以上（CQ:P<0.005**;CQ+CDDP:P<0.005**）。综合以上这些数据表明CQ抑制了肿瘤组织中的细胞自噬,并使M2巨噬细胞重新极化为M1表型,从而形成了以M1巨噬细胞占主体的TAMs群体。研究结论:在本课题中,我们证明了 CQ作为一种自噬抑制剂可以将TAMs从M2表型重新极化为M1表型。CQ可以在小鼠体内抑制喉癌Hep-2细胞的生长,并且很大程度上增强了 CDDP的治疗效果,这与CQ诱导的TAMs复极化有关。
职晓松[4]（2019）在《基于肝脏微环境因素的肝纤维化的致病机理和干预策略研究》文中进行了进一步梳理我国肝纤维化发病率高,可发展为肝硬化甚至肝癌,严重危害大众健康。然而,目前针对肝纤维化并未形成高效、成熟的治疗策略,这主要是因为,我们对肝纤维化微环境改变的认识仍缺乏全面性和深刻性,对肝纤维化微环境因素的干预仍缺乏靶向性和高效性。本课题立足于已知的肝纤维化的致病过程和新兴治疗策略,着眼于肝纤维化微环境内细胞、分子和理化因素之间的相互作用,分别从深化疾病认识和探索干预策略两个部分来对肝纤维化展开研究。第一部分:Clusterin在肝纤维化发生发展中的作用及机制研究。肝纤维化是一种由嗜肝病毒、酒精滥用、药物中毒、代谢性疾病、自身免疫性疾病等因素引起的慢性肝病。主要病理变化为,肝内结缔组织异常增生和大量细胞外基质沉积,多伴有炎症细胞浸润。肝纤维化持续加剧则会发展为肝硬化,甚至肝癌,严重危害健康。目前主要治疗策略为尽早去除病因;对于致病因素难以去除（如嗜肝病毒感染和自身免疫性疾病）或不可逆的肝纤维化,则尚未有较好的临床干预方法,这主要是由于对肝纤维化微环境变化了解不深入所致。研究和阐明肝纤维化微环境中细胞与细胞、细胞与分子之间相互作用对于控制肝纤维化进展具有重大意义。目前认为,肝纤维化发生发展的微环境改变是,肝实质细胞变性、坏死,分泌或/和释放炎性小体,募集和激活炎症细胞,活化后的炎症细胞（尤其是库否氏细胞）分泌TGFβ1、TNFα、PDGF等因子,激活肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）或其他致纤维化细胞使其转化为肌成纤维细胞（myofibroblasts）,肌成纤维细胞持续分泌和沉积细胞外基质,最终形成肝纤维化。因此,减少肝实质细胞损伤、减轻炎症反应、减弱HSCs活化对于抑制肝纤维化形成至关重要。Clusterin（CLU）,也称载脂蛋白J,是一种分泌蛋白,广泛存在于人体各组织和体液中。目前,CLU被报道具有多种生物学功能,如维持细胞内外蛋白质稳态、抑制细胞死亡、促进细胞存活、调节细胞自噬等。CLU也参与脑缺血损伤、阿尔茨海默症、肿瘤耐药、肺损伤修复、脂质沉积、肾纤维化等多个病理过程。但CLU在肝脏疾病,尤其在肝纤维化中的作用鲜有报道。我们前期工作发现,CLU在正常肝脏中低表达,而在肝纤维化组织中高表达,且特异性高表达于纤维化区域,这提示了CLU与肝纤维化发生发展的相关性。于是,我们提出以下科学问题:CLU是否通过调控肝实质细胞、炎症细胞、促纤维化细胞的生物学行为从而影响肝纤维化进展?为了明确CLU与肝纤维化发生发展的关系,我们进行了以下实验研究,结果如下:（一）建立了正常肝脏、肝纤维化、胆管纤维化、肝脂肪变、急性肝损伤五种小鼠模型,检测了CLU表达,发现CLU在肝纤维化和胆管纤维化模型中的表达显着高于其他模型,这提示了CLU与纤维化疾病的相关性;（二）描绘了CLU在肝纤维化模型的表达特征:随着纤维化程度加重,CLU在肝组织和血液中的蛋白表达均呈上升趋势,但CLU明显表达晚于HSCs明显活化;（三）描述了CLU表达的细胞类型:在正常肝脏,CLU高表达于中央静脉区个别肝细胞和门管区胆管细胞,低表达于其他肝细胞,不表达于静息HSCs;在纤维化肝脏,CLU高表达于纤维化区域损伤/坏死的肝细胞,低表达于正常肝细胞,不表达于活化HSCs（或肌成纤维细胞）,门管区胆管细胞CLU表达与正常肝脏相比未见明显变化;（四）利用腺相关病毒AAV构建了肝内过表达CLU的小鼠,建立肝纤维化模型,发现肝内过表达CLU能抑制HSCs活化和肝纤维化,促进体内肝细胞增殖并抑制肝细胞死亡,提示了CLU表达升高是肝纤维化的一种反馈调控;（五）利用慢病毒在体外构建了过表达CLU和敲减CLU的肝细胞系,证明了CLU促进肝细胞增殖,且通过抑制Caspase8/Caspase3轴从而抑制TNFα诱导的肝细胞凋亡,通过NFκB信号促进肝细胞存活,并在小鼠原代肝细胞中得到验证,这揭示了“CLU通过调控肝细胞生存和死亡途径从而抑制肝纤维化”的细胞学和分子机制;（六）分别利用肝星状细胞系HSC-T6和小鼠原代肝星状细胞,在培养体系中加入重组CLU蛋白,发现CLU不影响HSCs增殖,但可降低HSCs的活化水平,且CLU对HSCs的活化抑制作用是通过TGFβ/Smad通路介导,这揭示了“肝细胞旁分泌CLU抑制HSCs活化途径从而抑制肝纤维化”的细胞学和分子机制。结论:肝纤维化发生发展过程中受损肝细胞CLU反馈性高表达,一方面通过抑制肝细胞死亡、促进肝细胞存活恢复肝功能从而间接抑制肝纤维化进展,另一方面肝细胞旁分泌的CLU抑制HSCs活化从而直接抑制肝纤维化进展,这些结果丰富了对肝纤维化微环境因素自我调控的认识。第二部分:生理性低氧对诱导性肝脏干细胞的干性、扩增和定向分化的影响及机制研究。我国肝纤维化患者群体庞大,若未得到及时诊断和治疗,会发展为肝硬化,引起肝衰竭。传统意义上,肝纤维化所致的肝衰竭只能通过“肝移植”的方式来治疗。然而,“肝移植”费用昂贵,且我国肝衰竭群体庞大,供体来源极为匮乏,这极大地阻碍了“肝移植”技术的推广和应用。近年来,细胞治疗技术发展迅速。原位肝细胞移植治疗因价格低、操作简便、风险小等优点从而最可能成为“肝移植”治疗的替代方案。但是,肝细胞同样存在供体来源不足的问题。此外,肝细胞的高效和高活力分离技术尚不成熟,肝细胞体外不能稳定扩增,这限制了肝细胞移植治疗的发展。近几年,谱系重编程技术发展迅速,它极大地拓宽了细胞供体来源,在细胞治疗领域中显示出巨大潜力。诱导性肝干细胞系（induced hepatic stem cells,iHepSCs）由本实验室基于谱系重编程技术在国际上首次建立,在体外能稳定扩增,且在特定诱导条件下能分化为成熟肝细胞和胆管细胞,殖入I型遗传性酪氨酸血症（HT1）小鼠肝衰竭模型中能部分恢复肝脏功能,殖入DDC诱导的胆管纤维化小鼠模型后能分化为胆管细胞,这为肝衰竭的细胞治疗提供了极大的应用前景。然而,iHepSCs向肝细胞分化和胆管细胞分化的效率仍比较低,且殖入小鼠肝脏的效率也较低,这很可能是iHepSCs的培养条件和诱导条件不完善所致。近年来认为,成体干细胞位于特定的干细胞巢（stem cell niche）,巢内微环境改变可调控干细胞生物学行为,其中氧含量是影响干细胞干性、增殖和分化的一个关键微环境因素。生理性低氧是指正常生理状态下,体内的氧含量显着低于大气中的氧含量（21%）。最近证据表明,生理性低氧环境对间充质干细胞、神经干细胞、造血干细胞、诱导性干细胞的干性维持、扩大培养和定向分化具有显着调控作用,显示出良好的培养效果。但生理性低氧是否有利于增强iHepSCs干细胞特性和提高双向分化效率依然未知。肝脏接受双重供血,氧供较丰富,成体肝干细胞所在的门管区氧含量约9-11%,于是我们选取10%氧含量培养条件,模拟生理性低氧环境,以探索生理低氧对iHepSCs干性特征、增殖、肝向和胆向分化等生物学行为的影响。结果发现:（一）生理性低氧培养并未明显改变iHepSCs形态特征,其染色体核型正常;（二）生理性低氧能增强iHepSCs干性标志物CK19、Sox9、EpCAM和Lgr5的表达和增强单细胞集落形成能力;（三）生理性低氧明显降低胞内ROS水平,诱导HIF1α、HIF2α表达,揭示了干性增强的潜在机制;（四）生理性低氧通过p53-p21轴促进细胞周期G1/S转换从而促进iHepSCs增殖;（五）低氧性诱导提高了iHepSCs经Matrigel诱导的胆向分化效率,但降低iHepSCs肝向分化效率;（六）短期低氧预处理24h后再常氧诱导可以显着提高iHepSCs的肝向分化效率。结论:生理性低氧环境增强iHepSCs干性特征,提高iHepSCs体外扩增速率,低氧诱导提高其胆向分化效率,而低氧短期预处理法提高其肝向分化效率,这有助于探索基于微环境因素的干细胞生物学行为调控的干预策略,为优化应用型干细胞的适宜培养条件、探索肝衰竭的细胞治疗策略提供了重要借鉴。
邵晨[5]（2019）在《23-乙酰泽泻醇B抑制IgE/Ag介导的肥大细胞的激活和过敏反应》文中研究指明目的:本文利用小鼠骨髓来源肥大细胞（bone marrow-derived mast cells,BMMCs）、嗜碱性白血病细胞【rat basophilic leukemia（RBL）,RBL-2H3】和人肥大细胞（human mast cell,HMC-1）对三萜类化合物23-乙酰泽泻醇B（alisol B 23-acetate,AB23A）的体内外抗炎作用及机制进行研究,为新型抗炎药物的开发提供了理论依据和实验基础。方法:1.利用MTT方法检测不同浓度AB23A在BMMCs、RBL-2H3和HMC-1中无细胞毒浓度范围。2.利用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定AB23A对免疫球蛋白E（immunoglobulin E,Ig E）/抗原（antigen,Ag）激活的BMMCs中白三烯C4（leukotriene C4,LTC4）合成、组胺（histamine）释放、白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）生成等的影响。利用免疫荧光法测定AB23A对激活BMMCs内Ca2+动员的影响。3.利用Western Blot法检测不同浓度AB23A对Ig E/Ag激活的BMMCs、RBL-2H3及佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA）和钙离子载体（A23187）激活的HMC-1的不同通路相关蛋白,包括磷脂酶Cγ（phospholipase Cγ,PLCγ）、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶/核转录因子抑制蛋白/核转录因子（serine-threonine protein kinase/inhibitor of nuclear factor kappa-B kinases/nuclear factor kappa-B,Akt/IKK/NF-κB）、丝裂原活化蛋白激酶/胞浆磷脂酶A2（mitogen-activated protein kinases/cytosolic phospholipase A2,MAPKs/c PLA2）、环氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）等的表达或磷酸化水平的影响。4.利用免疫沉淀（immunoprecipitation,IP）法检测AB23A对Ig E/Ag激活的BMMCs中脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase,Syk）、Src家族激酶Lyn和Fyn相关表达及磷酸化水平的表达。5.利用小鼠被动皮肤过敏反应（passive cutaneous anaphylaxis,PCA）研究AB23A对Ig E/Ag介导小鼠体内抗炎作用,检测小鼠耳朵中伊文斯兰（Evansblue）的渗出量,并利用甲苯胺蓝染色法（toluidine blue）研究AB23A对小鼠耳肿胀程度及肥大细胞数目的影响。结果:1.MTT结果显示,AB23A浓度为2、5、10和20μM时对BMMCs、RBL-2H3和HMC-1均无明显细胞毒性作用。2.AB23A抑制Ig E/Ag介导BMMCs中组胺释放、LTC4合成、IL-6产生及钙离子动员。3.AB23A抑制Ig E/Ag介导的BMMCs中PLCγ、p38、ERK1/2、Akt、IKKα/β等的磷酸化水平和c PLA2、NF-κB等的核转位。4.AB23A抑制Ig E/Ag介导的BMMCs中Syk的磷酸化水平,但对Lyn及Fyn的磷酸化水平及表达均无影响。5.AB23A抑制Ig E/Ag介导的RBL-2H3及PMA和A23187介导的HMC-1中PLCγ、p38、ERK1/2、Akt、IKKα/β等的磷酸化水平和NF-κB的核转移水平。6.AB23A抑制Ig E/Ag介导的PCA反应,表现为降低Evans blue渗出量、减弱小鼠耳肿胀,但对肥大细胞数量无明显变化。结论:1.AB23A通过抑制Ig E/Ag介导的BMMCs中PLCγ的磷酸化水平抑制钙离子动员;通过抑制Ig E/Ag介导的BMMCs中p38、ERK1/2、c PLA2的磷酸化水平和c PLA2的核转位抑制LTC4的合成;通过抑制Ig E/Ag介导的BMMCs中Akt/IKK/NF-κB途径降低IL-6的产生和COX-2的表达;这些结果可能是依赖于AB23A抑制Ig E/Ag介导的BMMCs中Syk的磷酸化水平引起的。AB23A抑制Ig E/Ag介导的RBL-2H3及PMA和A23187介导的HMC-1中相关信号通路蛋白表达或磷酸化水平,这与AB23A作用于BMMCs中结果一致。2.在体内AB23A同样抑制Ig E/Ag介导肥大细胞激活而不是减少肥大细胞数量来抑制PCA反应。提示AB23A具有良好的体内外抗炎作用,具有成为抗炎先导化合物的潜能。本课题组首次系统地报道AB23A的抗炎作用及机理。
马立保[6]（2018）在《重组杨树菇凝集素（rAAL）的佐剂效应及机理研究》文中认为杨树菇凝集素（Agrocybe aegerita lectin,AAL）是从杨树菇中提取的一种活性成分,前期研究证明其具有抗病毒、刺激小鼠脾脏淋巴细胞增殖的作用,作为灭活病毒疫苗佐剂,可以提高小鼠抗病毒的抗体水平。禽流感病毒在全世界范围内流行,不仅会感染禽,给养禽业造成巨大损失,引发公共卫生问题,还会感染哺乳动物和人。疫苗免疫被证实是防治禽流感流行的有效方法。前期研究表明原核表达重组的AAL（rAAL）也具有增强免疫反应的作用,为了研究rAAL的佐剂效果,探讨佐剂的作用机理,开展以下试验:一、rAAL对灭活禽流感病毒H9N2的佐剂作用选择20±2g健康雄性Babl/c小鼠50只,随机分成5组,每组10只,分别为空白对照组、佐剂阴性对照组、佐剂阳性对照组（铝盐组）、0.5mg rAAL组、2.5mg rAAL组。空白对照组每只小鼠仅注射0.2ml PBS,其余各组每只小鼠注射0.1ml H9N2灭活病毒（灭活前病毒血凝效价27、70℃加热15min灭活）;佐剂阴性对照组再混合注射0.1ml PBS、佐剂阳性对照组（铝盐组）混合注射0.1ml铝盐,其余两组分别混合注射0.1ml rAAL（0.5 mg/kg BW）和0.1ml rAAL（2.5 mg/kg BW）,小鼠皮下注射,间隔7天免疫一次,共免疫4次。第四次免疫前每组随机挑出5只小鼠处死,摘取脾脏,分离各组免疫小鼠的脾脏淋巴细胞,流式细胞仪检查免疫小鼠脾脏淋巴细胞中CD4+T、CD8+T细胞的比例及CD4+T/CD8+T细胞比例,体外培养各处理组小鼠脾脏淋巴细胞,用灭活的H9N2病毒作为刺激物,CCK-8法检验各处理组小鼠的淋巴细胞增殖能力;第四次免疫7d后取血清,ELISA方法测定抗体水平;分离未免疫的小鼠脾脏淋巴细胞,荧光定量PCR检测小鼠脾脏淋巴细胞被不同浓度rAAL（10、25、50μg rAAL/ml）孵育24h后,细胞因子的基因表达水平。结果:2.5mg rAAL组血清中H9N2抗体水平（7.79±0.77）显着高于佐剂阴性组（5.43±1.94）（P<0.05）,0.5mg rAAL组（7.28±0.82）与佐剂阴性组差异不显着（P>0.05）,佐剂阳性对照组血清H9N2抗体水平（9.64±1.00）显着高于佐剂阴性组（P<0.05）。与空白对照组相比,各组小鼠脾脏淋巴细胞中CD4+T和CD8+T细胞数量均有升高的趋势（P>0.05）,0.5mg rAAL组CD4+T/CD8+T比例有所下降（P>0.05）,但均无显着性差异（P>0.05）。空白对照组、佐剂阴性对照组、佐剂阳性对照组、0.5mg rAAL组、2.5mg rAAL组小鼠脾脏淋巴细胞的刺激指数分别为0.93±0.26、3.49±2.01、3.91±1.95、5.53±2.57、2.47±1.78。与空白对照组相比,佐剂阴性对照组、佐剂阳性对照组和0.5mg rAAL组小鼠脾脏淋巴细胞的增殖能力极显着性增强（P<0.01）,2.5mg rAAL组小鼠脾脏淋巴细胞增殖能力显着提高（P<0.05）。与佐剂阴性对照组相比,0.5mg rAAL组小鼠脾脏淋巴细胞增殖能力显着增强（P<0.05）。用PBS溶液、浓度分别为10、25、50μg/ml的rAAL处理未免疫小鼠脾脏淋巴细胞24h后,IFN-γ相对表达量分别为0.82±0.24、1.73±0.93、1.33±0.32、1.56±0.46;与PBS液比较,浓度为10μg/ml和25μg/ml rAAL显着提高（P<0.05）,50μg/ml rAAL极显着提高（P<0.01）小鼠脾脏淋巴细胞IFN-γ的表达丰度。IL-10的相对表达量分别为1.00±0.37、1.37±0.43、2.91±0.72、3.86±0.86,10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml rAAL处理均极显着提高（P<0.01）小鼠脾脏淋巴细胞IL-10的表达丰度;IL-4、IL-17、TNF-α表达丰度在不同rAAL浓度之间的差异不显着（P>0.05）。试验结果表明:原核重组的AAL（rAAL）能增强H9N2的免疫原性,显着提高小鼠免疫灭活H9N2病毒后的抗体水平,体外能促进淋巴细胞的增殖,增加淋巴细胞因子IFN-γ、IL-10的表达,具有免疫佐剂的效果。二、注射rAAL后小鼠脾脏组织转录组分析20±2g健康雄性Babl/c小鼠60只,随机分成6组,每组10只,分别为空白对照组、佐剂阴性对照组、rAAL佐剂1组、rAAL佐剂2组、单独rAAL1组、单独rAAL2组。空白对照组仅注射0.2ml的PBS液,佐剂阴性对照组、rAAL佐剂1组、rAAL佐剂2组三组中每只小鼠均注射灭活的H9N2灭活病毒0.1ml（灭活前病毒血凝效价27、70℃加热15min灭活）,在此基础上三组分别混合注射0.1ml PBS、0.1ml rAAL（1mg/kg BW）和0.1ml rAAL（2.5mg/kg BW）;单独rAAL1组、单独rAAL2组分别注射0.1ml PBS+0.1ml rAAL（1mg/kg BW）和0.1ml PBS+0.1ml rAAL（2.5mg/kg BW）。皮下注射免疫小鼠,间隔7d免疫一次,二免后3d每组处死5只小鼠分离脾脏备用,其余小鼠四免后7d取血清测定血清中H9N2血凝抑制效价,选择血凝抑制效价最高的组进行后续的转录组学分析。结果:与佐剂阴性对照组相比,rAAL佐剂1组（H9N2+1mg rAAL/kg BW）显着提高了小鼠H9N2 HI效价（P<0.05）,rAAL佐剂2组（H9N2+2.5mg rAAL/kg BW）极显着提高了小鼠H9N2 HI效价（P<0.01）。选择rAAL佐剂2组（H9N2+2.5mg rAAL/kg BW）、单独rAAL2组（2.5mg rAAL/kg BW）、佐剂阴性对照组（0.1ml H9N2灭活病毒+0.1ml PBS）、空白对照组（0.2ml PBS）4个组（以下分别简称为H9N2+rAAL组、H9N2组、rAAL组、Control组）,每一个处理组选取5只小鼠的脾脏合为一个样提取总RNA,进行小鼠脾脏转录组学分析。结果如下:（1）对Control-vs-rAAL组的差异表达基因进行GO功能分析:揭示rAAL单独引起的变化。在细胞组分中,Control-vs-rAAL组的差异基因显着性富集于胞外区域和细胞分泌颗粒相关条目;在生物进程中,差异基因显着性富集于3类生物过程:免疫相关过程、应激刺激相关过程和物质代谢相关过程。其中免疫相关的生物过程,包括防御应答（defense response）、免疫反应（immune system process）、对细菌及细菌来源的分子应答（response to bacterium,response to molecule of bacterial origin）、炎症应答（inflammatory response）、白细胞迁移（leukocyte migration）、细胞活化（cell activation）。对rAAL处理组差异基因进行GO生物功能富集分析,发现差异基因显着富集于22个生物条目,6个为免疫相关的条目,同时出现在6个免疫相关条目的差异表达基因为IL-1。分析差异基因显着富集的生物过程相互关系网络图,发现与免疫相关条目中,炎症应答（inflammatory response）和白细胞迁移（leukocyte migration）位于网络中分支较为末端的位置,说明rAAL处理可能影响到了机体的炎症应答以及白细胞迁移方面的生物过程。代谢通路分析显示,rAAL组与Control组差异基因显着性富集于7个代谢通路（Pathway）,其中5个Pathway与免疫相关,分别为细胞因子-细胞因子受体相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction）、造血细胞谱系（Hematopoietic cell lineage）、疟疾（Malaria）、非洲锥虫病（African trypanosomiasis）、金黄葡萄球菌感染（Staphylococcus aureus infection）。显着性（log2（rAAL/control）绝对值>1,FDR<0.01）富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用通路中相关的差异表达基因21个,显着性（log2（rAAL/control）绝对值>1,FDR<0.01）富集于造血细胞谱系中相关的差异表达基因12个。通过归纳和通路分析发现14个显着性差异表达基因:IL-1β、Itgam（CR3）、Itgb2l、MMP-9、PF-4、Ppbp（CXCL7）、CXCL5、Cxcr1、Cxcr2、Selp、G-CSFR显着上调,Ccl3、Ccl4、Ccl8显着下调。这14个基因贯穿于白细胞跨内皮迁移整个过程:初级黏附（滚动）、淋巴细胞活化、次级黏附（牢固粘附）,上调表达的基因对中性粒细胞跨内皮迁移具有促进作用。分析H9N2-rAAL-vs-H9N2、rAAL-vs-H9N2得到与AAL-vs-Control组非常一致的变化规律、促进中性粒细胞跨内皮迁移的基因上调表达。（2）H9N2-vs-H9N2+rAAL的差异表达基因GO功能分析:揭示与H9N2共同免疫后,rAAL引起的变化,发现在细胞组分的项目中差异基因显着性富集于细胞外区域相关的条目中;在生物过程富集分析中,差异基因显着富集于脂蛋白和胆固醇相关生物过程。KEGG分析差异基因显着性富集于8个通路,其中6个通路都与物质代谢相关,1个与免疫相关:非洲锥虫病（African trypanosomiasis）。将富集到生物过程中所有免疫相关条目中的差异基因进行了归纳分析,结果8个基因多次重复出现在这些免疫相关的条目中,分别为Ido1、Cfd、2m、Adipoq、Cd209b、Id1、Itgb4、Neil1。这8个基因的上调表达促进了白细胞粘附、迁移和T细胞分化。转录组学研究结果说明,rAAL具有上调小鼠脾脏IL-1β的表达、趋化中性粒细胞跨内皮迁移、促进淋巴细胞趋化和分化的作用。三、注射rAAL后小鼠脾脏miRNA差异表达研究利用与试验二同样的样品,开展soleax miRNA高通量测序,结果如下:1.rAAL-vs-control组显着性差异表达的miRNA有73个,显着性下调的miRNA有13个,显着性上调的有60个,其中mi R-124-3p极显着下调,mi R-3473e极显着上调。通过RNAhybrid软件预测rAAL-vs-control组的已知差异表达miRNA的靶基因数量29978,对靶基因GO富集分析没有显着性富集的条目（term）,KEGG代谢通路分析没有显着性生物学统计意义的Pathway,但在前20个KEGG通路中与免疫相关的通路有7个,在细胞粘附分子生物进程中抗原递呈细胞（APC）、T淋巴细胞、细胞毒T细胞的表面广泛分布着差异表达的miRNA靶基因。2.H9N2+rAAL-vs-H9N2两组之间显着性差异表达的miRNA有57个,H9N2+rAAL组比H9N2组显着性下调的miRNA有38个,显着性上调的有19个,其中mi R-124-3p显着性下调,mi R-3473e显着性上调。通过RNAhybrid软件预测H9N2+rAAL-vs-H9N2的已知差异表达miRNA的靶基因数量298876,对靶基因GO富集分析没有显着性富集的term和显着性生物学统计意义的Pathway,但在前20个KEGG通路中与免疫相关的通路有6个。在细胞粘附分子进程中,与rAAL-vs-control组基本相同的是抗原递呈细胞（APC）、T淋巴细胞、细胞毒T细胞的表面广泛分布着差异表达miRNA的靶基因。两两比较四个处理组中一致性变化的miRNA,rAAL处理导致了mi R-124-3p显着性下调（P<0.01）、mi R-3473e的显着性上调（P<0.01）。应用mi Randa、RNAhybrid、targetscan同时预测mi R-124-3p的靶基因,三个软件共同预测到的靶基因1800个。靶基因GO功能分析显示mi R-124-3p的靶基因集中在22个生物进程中,显着性（P<0.05）生物富集在12个与代谢相关联的生物进程。具有生物统计显着性富集的代谢通路有5条,均与免疫相关,同时出现在5条KEGG通路中的基因是:NM001168508、NM001168513、NM001168514、NM011951、NM009045。从NCBI中搜索这五个ID对应的基因名称,前面四个ID均为p38,NM009045为P65,涉及MAPK信号通路和NF-κB信号通路。在转录组学中rAAL组与control组相比,rAAL组小鼠脾脏中p38表达量极显着升高。miRNA研究结果表明:rAAL下调小鼠脾脏mi R-124-3p（P<0.01）表达,激活MAPK通路和NF-κB信号通路,增加小鼠的免疫反应。综上所述,rAAL具有免疫佐剂的作用,可增强H9N2的免疫原性,主要通过增加IL-1β的转录、下调miRNA-124-3p表达,激活MAPK信号通路和NF-κB信号通路,促进中性粒细胞细胞跨内皮迁移,促进淋巴细胞分化。试验结果为新型疫苗佐剂的研究提供基础数据。
殷浩[7]（2018）在《在一个巴基斯坦近亲结婚的家系中FANCM纯合移码突变导致男性不育的研究》文中指出精子发生包括原始生殖细胞（primordial germ cells,PGCs）形成、迁移、增殖和分化,性原细胞增殖、静息和迁移,精原（干）细胞自我更新和分化,精母细胞减数分裂和精细胞变态形成精子一系列连续过程。其中任何一步发生异常,都会导致精子畸形、运动能力下降或数目减少（如临床上常见的畸、弱、少精子症）,乃至无法形成（即临床上常见的无精子症）,从而引发男性不育。男性不育影响约7%的男性。遗传因素可能是生精障碍的主要原因,但在大多数病例中,其发病病因仍不清楚。本论文对一个巴基斯坦近亲结婚后代发生男性不育的家系进行研究,以期揭示其不育的原因。父母为表兄妹结婚,生育四个儿子,其中三个不育,两位为少弱精子症患者,另一位是无精子症患者。通过全外显子组和Sanger测序,筛选到范可尼贫血（Fanconi Anemia,FA）核心复合物成分FANCM的一个移码突变（c.1946<sub>1958del,p.P648Lfs*16）与不育症共分离,认为是该家系不育患者的潜在致病突变。因为FANCM参与DNA链间交联（interstrandcrosslink,ICL）损伤修复,所以我们检测患者外周血淋巴细胞对MMC诱发染色体断裂的敏感性。结果表明,相比于其父亲,患者的淋巴细胞呈现染色体断裂增加,且断裂频率随MMC浓度的增高而增多,提示该FANCM突变破坏其功能,并导致ICL损伤修复缺陷。HEK293T细胞实验证实:该FANCM移码突变可导致截短蛋白形成,使FANCM不能定位于ICL位点,进而引起FANCD2不能被单泛素化、FA通路不能激活,最终导致ICL无法修复和细胞死亡。我们制备了携带与患者几乎一致的Fancm突变（Fancm△C/△C）小鼠,发现纯合突变小鼠与患者表型类似,即:精子发生障碍、生育力大幅降低。具体表现为精子数目显着减少、运动能力降低,各级生精细胞大量丢失和圆形精细胞停滞。进一步发现:精原细胞对MMC敏感性增强、增殖受损和圆形精细胞DNA损伤修复缺陷,但减数分裂前期进程未受影响。有趣的是,所有患者和Fancm△C/△C成年小鼠均无明显的出生缺陷、骨髓造血功能衰竭、肿瘤或癌症等FA的典型症状。综上,本论文第一次发现FANCM纯合突变导致生精障碍,引起男性不育,但不引起骨髓造血功能衰竭;提供了 FANCM纯合突变导致非典型FA（我们定义为FA-M）的直接证据,为雄性不育及FA的诊断和遗传咨询提供指导。
黎娜[8]（2016）在《LAG3参与小鼠急性肺损伤炎症消退及其可能机制研究》文中进行了进一步梳理目的急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）是以进行性呼吸窘迫和难治性低氧血症为临床特征的急性呼吸衰竭综合征。脓毒症是急性呼吸窘迫综合征的常见病因。目前ARDS的主要治疗方式为肺保护性通气策略、ECCO及相关对症治疗,治疗效果欠佳。炎症是机体抵御病原微生物和组织损伤有效的宿主防御手段。在炎症刺激的作用下,机体激活大量的炎症细胞中和或清除致病因子,从而恢复内环境稳态。炎症消退是从炎症激活状态恢复到稳态的主动的程序化过程。有关炎症消退的调控机制广为接受的是巨噬细胞及其分泌的种类多样的促炎症消退介质。近年来多项研究逐渐揭示,CD4+CD25+Treg也是促进急性肺损伤炎症消退的重要因素之一。CD4+CD25+Treg除了广为熟悉的淋巴细胞的免疫抑制作用外,还通过非TCR依赖的方式促进组织修复。淋巴细胞活化基因3分子（lymphocyte activation gene3,LAG3,CD223）是免疫球蛋白超家族的一员,已有研究表明LAG3分子与CTLA-4和PD-1相似,作为负性共刺激分子,其激活可负向调控淋巴细胞功能。同时也有研究表明,LAG3是CD4+CD25+Treg抑制性功能最大化的必要条件。LAG3分子在急性肺损伤炎症消退中扮演何种作用,干预LAG3分子的表达水平能否影响急性肺损伤炎症消退,目前尚未见报道。为此,本实验拟以LPS气管内注射诱导的急性肺损伤为动物模型,观察病程全程小鼠肺内不同免疫细胞的计数及LAG3分子在各种淋巴细胞上的表达变化;并探讨LAG3基因敲除是否影响小鼠急性肺损伤炎症消退进程,并以此探索急性肺损伤中炎症消退延迟的治疗合理可靠的免疫靶点。方法1、采用LPS气管内注射诱导的急性肺损伤模型,建模前及建模后10d测量小鼠体重,评估急性肺损伤在建模后不同时间点炎症消退的动态变化。2、采用LPS气管内注射致急性肺损伤模型,将28只C57BL/6小鼠随机分为假手术组（n=4）、lps1d组（n=6）、lps4d组（n=6）、lps7d组（n=6）及lps10d组（n=6）,取肺组织,he染色检测病理改变,并进行肺损伤评分,评估急性肺损伤在建模后不同时间点炎症消退的动态变化;取肺泡灌洗液和肺组织,流式细胞仪检测急性肺损伤小鼠建模后不同时间点肺泡灌洗液和肺组织中cd4+t淋巴细胞、cd8+t淋巴细胞、cd19+b淋巴细胞、自然杀伤（naturalkiller,nk）细胞、cd4+cd25+调节性t淋巴细胞（regulatorytcells,treg）、树突状细胞（dendriticcell,dc）的计数动态变化,以及cd4+t淋巴细胞、cd8+t淋巴细胞、cd19+b淋巴细胞、dc细胞和cd4+cd25+调节性t淋巴细胞上的lag3表达水平。3、利用lag3基因敲除小鼠及野生型小鼠建立急性肺损伤模型,随机分为假手术组（n=4）及lps组（n=6）,建模术前及术后10d每天记录每只小鼠体重变化。4、利用lag3基因敲除小鼠及野生型小鼠建立急性肺损伤模型,各28只。组内在随机分为假手术组（n=4）、lps1d组（n=6）、lps4d组（n=6）、lps7d组（n=6）及lps10d组（n=6）。56只小鼠分两批同时建模,取肺组织行病理切片染色观察及肺损伤病理评分;取肺泡灌洗液,检测中性粒细胞计数及总蛋白含量;检测cd4+cd25+treg的计数。结果1、假手术组10d内体重略有增加,无统计学意义。lps组体重1d下降;4d降至最低,与1d相比有统计学意义;7d体重明显下降,10d基本恢复正常。2、假手术组在各个时间点均无明显肺组织病理学改变。lps组的肺组织病理损伤评分1d最高;4d稍有下降,与1d相比无统计学意义;7d评分明显下降,10d基本恢复正常。3、急性肺损伤术后,小鼠肺泡灌洗液中cd11b+ly6g+中性粒细胞、cd11c+mhcⅡ+cd11b+dc、nk1.1+nk细胞的计数1d升高、4d达到高峰,7d下降（p值均小于0.05）;小鼠肺泡灌洗液中cd4+t淋巴细胞、cd4+cd25+treg4d开始出现升高、7d达到高峰,,10d仍未见明显下降（p值均小于0.05）;小鼠肺泡灌洗液中cd8+t淋巴细胞、cd19+b细胞及dc细胞数量未见明显变化。小鼠肺组织中各类免疫细胞的变化与肺泡灌洗液中的变化类似。4、急性肺损伤术后,小鼠肺泡灌洗液及肺组织中cd4+t细胞及cd4+cd25+treg细胞表面的lag3表达呈现出相似的变化趋势,4d开始出现升高、7d达到高峰（p值均小于0.05）。cd8+t细胞及cd19+b细胞上的lag3表达水平未见明显变化。5、利用lag3基因敲除小鼠（lag3ko）及野生型小鼠建立急性肺损伤模型,lag3基因敲除小鼠及野生型小鼠术后1d体重出现降低,4d降至最低,此后出现回升。与野生型小鼠相比,lag3ko小鼠术后7d体重回升小,10d仍未恢复至术前水平（p值均小于0.05）。lag3ko小鼠及野生型小鼠间比较,1d及4d的体重未见统计学差异;建模后1d和4d,lag3ko小鼠及野生型小鼠肺损伤病理评分无差异。建模后7d及10d,lag3基因敲除小鼠病理损伤评分均高于野生型小鼠（p值均小于0.01）。6、利用lag3基因敲除小鼠及野生型小鼠建立急性肺损伤模型,建模后1d和4d,lag3基因敲除小鼠及野生型小鼠肺泡灌洗液中性粒细胞计数无差异。建模后7d及10d,lag3基因敲除小鼠肺泡灌洗液中性粒细胞计数均高于野生型小鼠（p值均小于0.01）。7、利用lag3基因敲除小鼠及野生型小鼠建立急性肺损伤模型,建模后1d和4d,lag3基因敲除小鼠及野生型小鼠肺泡灌洗液总蛋白含量无差异。建模后7d及10d,lag3基因敲除小鼠肺泡灌洗液总蛋白含量均高于野生型小鼠（p值均小于0.01）。8、利用lag3基因敲除小鼠及野生型小鼠建立急性肺损伤模型,结果提示7d及10d这两个时间点,lag3基因敲除小鼠treg数量较野生型小鼠显着下调,有统计学意义（p值均小于0.01）。在1d和4d这两个时间点,两种小鼠间比较无统计学差异。结论本模型急性肺损伤在1d-4d为肺部炎症的急性期,7d-10d为炎症消退期。肺内各类免疫细胞数量的动态改变提示中性粒细胞、dc细胞、nk细胞主要作用于肺损伤炎症急性期,cd4+t细胞、cd4+cd25+treg细胞及巨噬细胞主要作用于肺损伤炎症消退期。其中cd4+cd25+treg的数量在急性肺损伤炎症消退期出现增多且lag3在cd4+cd25+treg上的表达在炎症消退期也出现上调。lag3基因敲除小鼠急性肺损伤炎症消退出现延迟,提示lag3参与调控急性肺损伤炎症消退,可能与lag3对CD4+CD25+Treg的功能调控有关。
杨芳[9]（2013）在《鸡蛋胆固醇营养效果及其脂质调控成分筛选与机理研究》文中研究指明针对鸡蛋胆固醇其营养作用目前仍有争议的现状,本文以鸡蛋及其活性成分作为研究对象,开展了鸡蛋胆固醇营养动物实验、鸡蛋调控胆固醇活性成分的筛选及鸡蛋活性脂质调控胆固醇吸收代谢的机理研究等系列工作。主要的研究内容和主要研究成果摘要如下：本实验以健康Sprague Dawley大鼠为动物模型,摄入同等胆固醇含量的化学胆固醇（CLG）、蛋黄（EYG）、全蛋（WEG）及不含胆固醇的普通饲料（CCG）进行饮食干预90d,系统检测胆固醇及其代谢物在大鼠体内各脏器、血液及粪便中的含量,通过肝脏切片观察病变,运用RT-qPCR检测胆固醇相关代谢酶的转录水平表达。实验结果发现EYG组与WEG组大鼠的身体状况、血脂、肝脂等与CCG组相比无显着差异,但与CLG组相比较,其肝脏TG、TC及LDL-胆固醇,肝脏TG与TC,肝脏损伤程度,肝脏羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMG-CoAR）与酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶（ACAT）的mRNA表达量都显着性地降低；而肝脏HDL-胆固醇与TBA,粪便中性固醇与TBA,肝脏低密度脂蛋白受体（LDLr）、胆固醇-7α羟化酶（CYP7A1）与卵磷脂-胆固醇酰基转移酶（LCAT）的mRNA表达量均显着性地升高。实验结果表明鸡蛋对健康SD大鼠血脂无显着性影响,鸡蛋的摄入能显着抑制胆固醇体内从头合成及以胆固醇酯的形式在体内储存,促进了胆固醇向胆汁酸的转化,并随粪便排出。建立了体外Caco-2细胞单层吸收模型,并从形态学、酶学、跨膜电阻及通透率对其进行评估。实验结果发现经过21d培养的Caco-2细胞可以作为小肠吸收的体外模型,倒置显微镜与电镜检查,发现细胞单层模型的A侧分化形成微绒毛与细胞间形成了完整的紧密连接结构,细胞单层模型的跨膜电阻值均符合220Ω·cm2-600Ω·cm2（?）勺要求,细胞单层的标志性酶（碱性磷酸酶）活力增加表现出明显的极化,荧光黄A-B侧转运的渗透系数低于转运实验规定的1.0×10-6cm/s。上述结果表明建立的Caco-2细胞单层模型符合物质转运实验的条件,可以作为胆固醇吸收转运研究的体外模型。以Caco-2细胞单层为模型,研究了一系列浓度的胆固醇在不同pH值下的双向转运情况,以及NPC1L1蛋白抑制剂依折麦布（Eetimibe）对胆固醇细胞转运的影响。实验结果发现,胆固醇在Caco-2细胞单层模型中的转运表现为一定的浓度与pH值依赖性和饱和性,在胆固醇添加浓度为100μmol/L供液pH值为7.4条件下,胆固醇在Caco-2细胞单层模型中的转运渗透系数最高,其摄入比为4.73,胆固醇在Caco-2细胞单层吸收过程中受到载体转运蛋白的调节,而胆固醇外排是以被动扩散的方式转运。当加入Ezetimibe （10μmol/L）之后胆固醇摄入比显着降低。实验结果说明胆固醇在Caco-2细胞单层模型中的转运为载体蛋白NPC1L1介导的主动转运。以Caco-2细胞单层为模型,提取鸡蛋中脂质、蛋白质类组分,借助体外人工胃肠模拟消化系统,采用液体闪烁追踪3-H-胆固醇,研究各组分对胆固醇在Caco-2细胞单层模型中摄取与转运的影响。实验结果发现,鸡蛋中的蛋白质（蛋清总蛋白质、蛋黄总蛋白质及卵黏蛋白）、磷脂（卵磷脂与神经鞘磷脂）及n-3系列的多不饱和脂肪酸（EPA与DHA）能显着地抑制Caco-2细胞中胆固醇的摄取与转运,棕榈酸与溶血卵磷脂能够促进Caco-2细胞中胆固醇的摄取与转运,而单不饱和脂肪酸与脑磷脂对Caco-2细胞中胆固醇的摄取与转运无显着性影响。上述结果表明鸡蛋中含有调控胆固醇吸收转运的成分,为进一步揭示其对胆固醇代谢网络的调控及机制提供理论基础。考察鸡蛋各磷脂成分对胆固醇微胶束化学组成、牛磺胆酸钠结合能力、微胶束中胆固醇与牛磺胆酸盐的溶解能力及微胶束分子量变化的影响。实验结果发现,蛋黄卵磷脂与神经鞘磷脂的添加促进了胆固醇参与微胶束的形成,且随着添加量的增加使得牛磺胆酸钠的结合能力增强。当微胶束孵育24h后,蛋黄卵磷脂与神经鞘磷脂组的盐溶液中胆固醇溶解度显着地低于其他组,蛋黄神经鞘磷脂组的牛磺胆酸钠的溶解度显着性降低。此外,微胶束的分子量随着蛋黄卵磷脂与神经鞘磷脂添加浓度的增加而增加,表明微胶束释放的速度受到了这两种磷脂的约束,减慢了微胶束中胆固醇通过静止水层向肠上皮细胞转运前的释放过程。以上结果表明鸡蛋卵磷脂与神经鞘磷脂通过改变胆固醇混合微胶束的物理化学性质,在一定程度上抑制了微胶束向小肠上皮细胞的转运过程。通过RT-qPCR与Western-blot检测不同浓度鸡蛋卵磷脂与神经鞘磷脂对Caco-2细胞胆固醇吸收通路中关键蛋白转录与翻译水平表达的影响。实验结果发现鸡蛋卵磷脂与神经鞘磷脂均能显着性抑制小肠胆固醇吸收关键蛋白NPC1L1（尼曼-匹克C1型类似蛋白1）的转录与翻译,从而抑制胆固醇在Caco-2细胞中的摄入与转运。鸡蛋卵磷脂与神经鞘磷脂对于NPC11L基因与蛋白表达的抑制可能与转录因子SREBP（固醇调节元件结合蛋白）激活受到抑制相关。鸡蛋卵磷脂通过促进胆固醇合成HDL的方式移除Caco-2细胞中多余的胆固醇。此外,高浓度的蛋黄神经鞘磷脂有可能通过下调Caveolin1基因表达从而抑制胆固醇的吸收。通过RT-qPCR与Western-blot检测鸡蛋中六种脂肪酸（PA、OA、LA、AA、EPA、 DHA）对Caco-2细胞胆固醇吸收通路中关键蛋白转录与翻译水平表达的影响。实验结果发现EPA与DHA均能显着性抑制小肠胆固醇吸收关键蛋白NPC1L1的转录与翻译,从而抑制胆固醇在Caco-2细胞中的摄入与转运,而高浓度的PA与OA通过促进NPC1L1基因的转录表达使得胆固醇在Caco-2细胞中的摄入与转运增加,且NPCL1L基因的下调与转录因子SREBP受到抑制相关。高浓度的AA与EPA通过抑制ABCA1（三磷酸腺苷结合盒转运体A1）的活性,从而抑制Caco-2细胞中胆固醇以合成HDL的方式外排,而高浓度的PA与OA通过上调ACAT2的转录表达促进胆固醇转化为胆固醇酯最终参与乳糜微粒的形成。一定浓度的EPA与DHA抑制了Caveolin1mRNA的表达,表明EPA与DHA有可能通过下调Caveolin1基因表达抑制胆固醇的吸收。
王建欣,杨继章[10]（2011）在《玻璃体内注射型缓释微粒给药系统的研究进展》文中研究表明 对于眼后段疾病的治疗,自20世纪40年代就开始探索玻璃体内注射给药。然而药物在眼内的半衰期一般较短,要维持治疗浓度需频繁注射,不仅患者难以接受,且易引起多种并发症,药物浓度也会大幅度波动,甚至产生毒性作用。为此一种新的眼部载药系统——玻璃体内注射型缓释微粒给药系统应
二、维生素A从循环向组织转运存在多种途径（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、维生素A从循环向组织转运存在多种途径（论文提纲范文）
（1）基于TLR4/NF-κB通路探讨SDR9C7基因在急性肺损伤模型中作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 引言 |
| 1.1 急性肺损伤概述 |
| 1.1.1 急性肺损伤流行病学 |
| 1.1.2 急性肺损伤定义 |
| 1.1.3 急性肺损伤发病机理 |
| 1.2 脂多糖诱导的急性肺损伤机制研究进展 |
| 1.2.1 肺细胞中LPS信号转导机制 |
| 1.2.2 肺泡上皮I型细胞 |
| 1.2.2.1 ATI细胞功能简述 |
| 1.2.2.2 ATI细胞与LPS的相互作用 |
| 1.2.3 肺泡上皮II型细胞 |
| 1.2.3.1 ATII细胞功能简述 |
| 1.2.3.2 ATII细胞与LPS的相互作用 |
| 1.2.3.3 肺表面活性剂与LPS的相互作用 |
| 1.2.4 内皮细胞 |
| 1.2.5 肺泡巨噬细胞(AM) |
| 1.2.5.1 肺泡巨噬细胞功能 |
| 1.2.5.2 肺泡巨噬细胞与脂多糖的相互作用 |
| 1.2.6 肺成纤维细胞 |
| 1.3 TLR4/NF-κB通路概述 |
| 1.3.1 TLR4 研究进展 |
| 1.3.2 NFκB研究进展 |
| 1.3.3 Toll/ TLR信号通路 |
| 1.4 SDR9C7 的研究概况 |
| 1.4.1 SDR9C7 简介 |
| 1.4.2 SDR9C7是ARCI的一个致病分子 |
| 1.4.3 SDR9C7 与其他分子的相互作用 |
| 1.4.4 缺乏SDR9C7 的患者皮肤感染的风险更高 |
| 1.4.5 SDR9C7 患者角质层特有的神经酰胺成分 |
| 1.4.6 Sdr9c7 基因敲除小鼠的建立及鉴定 |
| 1.4.7 SDR9C7 在皮肤屏障形成中的重要作用 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试动物及细胞 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 脂多糖诱导ALI模型 |
| 2.2.2 HE染色观察小鼠肺组织形态学 |
| 2.2.2.1 制作小鼠肺组织石蜡切片 |
| 2.2.2.2 HE染色 |
| 2.2.2.3 肺组织病理评分 |
| 2.2.3 实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)检测IL-1β、TNF-a、IL-6和SDR9C7 基因的表达情况 |
| 2.2.4 Western Blot检测小鼠肺组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达 |
| 2.2.5 细胞实验 |
| 2.2.5.1 SDR9C7-小干扰RNA(SmallinterferingRNA,siRNA)抑制效果验证 |
| 2.2.5.2 RT-PCR检测A549 细胞IL-1βm RNA、TNF-am RNA、IL-6m RNA和SDR9C7m RNA表达 |
| 2.2.5.3 Western Blot检测A549 细胞TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达 |
| 2.3 统计学方法 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 ALI模型小鼠肺组织形态学观察及病理评分 |
| 3.2 ALI模型小鼠肺组织TLR4/NF-κB通路表达 |
| 3.3 SDR9C7、IL-1β、TNF-a和 IL-6 基因在ALI模型小鼠肺组织中表达 |
| 3.4 ALI模型小鼠肺组织SDR9C7 基因表达与病理评分相关性分析 |
| 3.5 敲低SDR9C7 基因表达验证结果 |
| 3.6 敲低SDR9C7 基因对LPS诱导A549 细胞TLR4/NF-κB通路的影响 |
| 3.7 敲低SDR9C7 基因对LPS诱导A549 细胞IL-1β、TNF-α、IL-6、SDR9C7 基因表达的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 主要英文缩略语索引 |
| 硕士攻读期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（2）超重、肥胖儿童血清微量营养素水平分析（论文提纲范文）
| 中文论着摘要 |
| 英文论着摘要 |
| 英文缩略语 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 一、综述 锌、铁、钙缺乏与儿童肥胖研究进展 |
| 参考文献 |
| 二、在学期间科研成绩 |
| 三、致谢 |
| 四、个人简介 |
（3）抑制自噬诱导肿瘤相关巨噬细胞复极化和增强喉癌细胞对顺铂的化学敏感性（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 巨噬细胞概述 |
| 1.1.1 巨噬细胞前体的起源 |
| 1.1.2 巨噬细胞分型 |
| 1.2 巨噬细胞极化 |
| 1.2.1 炎症反应过程中的巨噬细胞极化 |
| 1.2.2 巨噬细胞的极化调控 |
| 1.3 巨噬细胞与肿瘤 |
| 1.3.1 巨噬细胞在癌症中的起源和作用 |
| 1.3.2 TAMs阻碍了当前临床肿瘤治疗的疗效 |
| 1.3.3 靶向TAMs:临床前实验和临床试验 |
| 1.4 自噬概述 |
| 1.4.1 自噬和巨噬细胞模式识别受体(PRRs) |
| 1.4.2 自噬和巨噬细胞中的炎症通路 |
| 1.5 自噬介导的巨噬细胞调控机制 |
| 1.5.1 自噬促进单核细胞向巨噬细胞分化 |
| 1.5.2 自噬调控巨噬细胞极化 |
| 1.5.3 自噬调控巨噬细胞吞噬功能 |
| 1.5.4 自噬调控巨噬细胞代谢 |
| 1.5.5 自噬影响巨噬细胞死亡 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 体外巨噬细胞极化 |
| 2.3 体外巨噬细胞再极化 |
| 2.4 实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR) |
| 2.5 蛋白质印迹 |
| 2.6 体外吞噬实验 |
| 2.7 体外药物敏感性测定 |
| 2.8 细胞活力测定实验(MTT) |
| 2.9 肿瘤生长模型 |
| 2.10 免疫组化和免疫荧光 |
| 2.11 自噬检测 |
| 2.12 流式细胞仪分析 |
| 2.13 统计分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 M1和M2巨噬细胞体外极化 |
| 3.2 自噬抑制剂CQ在体外诱导M2巨噬细胞复极化为M1表型 |
| 3.3 M2至M1复极化可增强巨噬细胞的吞噬作用并恢复肿瘤细胞对CDDP的敏感性 |
| 3.4 CDDP,CQ和CQ/CDDP联合疗法在体内的抗肿瘤活性 |
| 3.5 CQ抑制Hep-2肿瘤中的细胞自噬并使TAMs复极化为M1表型 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文 |
（4）基于肝脏微环境因素的肝纤维化的致病机理和干预策略研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 Clusterin在肝纤维化中发生发展中的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 一、不同肝损伤模型中CLU的表达情况 |
| 二、肝纤维化模型中CLU的表达特点和规律 |
| 三、肝内CLU的表达对肝纤维化发生发展的影响 |
| 四、CLU抑制肝纤维化的细胞学机制和分子机制探究 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 生理性低氧对诱导性肝脏干细胞的干性、扩增和定向分化的影响及机制研究 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 一、低氧培养的iHepSCs的形态特征和染色体核型 |
| 二、低氧培养的iHepSCs的干性特征 |
| 三、低氧培养对iHepSCs增殖能力的影响 |
| 四、低氧培养影响iHepSCs干性和扩增的机制探究 |
| 五、低氧培养对iHepSCs双向分化潜能的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（5）23-乙酰泽泻醇B抑制IgE/Ag介导的肥大细胞的激活和过敏反应（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 对象和方法 |
| 1 实验对象 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 BMMCs |
| 2.2 实验用动物 |
| 2.3 主要试剂及来源 |
| 2.4 主要仪器设备 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 试剂配制 |
| 3.2 细胞培养 |
| 3.3 细胞增殖抑制实验 |
| 3.4 AB23A对 IgE/Ag诱导的BMMCs内组胺释放及钙离子动员的检测 |
| 3.5 AB23A对 IgE/Ag诱导的BMMCs内 LTC4合成量的测定 |
| 3.6 AB23A对 IgE/Ag诱导的BMMCs内 IL-6 生成量的测定 |
| 3.7 Western Blot |
| 3.8 免疫沉淀(immunoprecipitation,IP) |
| 3.9 小鼠被动皮肤过敏反应(PCA反应) |
| 3.10 甲苯胺蓝染色 |
| 3.11 统计分析方法 |
| 结果 |
| 1 AB23A通过抑制PLCγ磷酸化抑制IgE/Ag刺激的BMMCs中的组胺释放和Ca2+动员 |
| 2 AB23A通过阻断p38和ERK的磷酸化以及c PLA2的核转移来抑制LTC4的产生 |
| 3 AB23A通过抑制Akt/IKK/NF-κB通路降低IL-6和COX-2 的表达 |
| 4 AB23A抑制Syk相关通路 |
| 5 AB23A抑制RBL-2H3和HMC-1 的激活蛋白 |
| 6 AB23A抑制IgE介导的被动皮肤过敏反应(PCA反应) |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 萜类化合物抗炎作用研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）重组杨树菇凝集素（rAAL）的佐剂效应及机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviations) |
| 第一章 文献综述 |
| 1 免疫佐剂 |
| 1.1 免疫佐剂的概念 |
| 1.2 免疫佐剂的种类 |
| 1.2.1 增加免疫原性的佐剂 |
| 1.2.2 具备免疫刺激性的佐剂 |
| 1.2.3 兼具增加免疫原性和免疫刺激性的佐剂 |
| 2 杨树菇凝集素 |
| 2.1 天然提取的杨树菇凝集素(AAL) |
| 2.2 原核重组的杨树菇凝集素(rAAL) |
| 3 转录组学 |
| 3.1 转录组 |
| 3.2 高通量测序技术 |
| 3.3 高通量测序的数据处理 |
| 4 miRNA |
| 4.1 miRNA的概念及生物体内形成 |
| 4.2 miRNA靶基因预测 |
| 4.3 miRNA与免疫 |
| 4.3.1 miRNA与血细胞分化 |
| 4.3.2 miR-124研究进展 |
| 5 免疫细胞 |
| 5.1 T淋巴细胞和B淋巴细胞分化及分类 |
| 5.2 白细胞跨内皮迁移 |
| 6 禽流感 |
| 问题提出 |
| 第二章 rAAL对灭活禽流感病毒H_9N_2的佐剂作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 试验动物 |
| 1.1.3 试验试剂及主要溶液配方 |
| 1.1.4 主要试验器材 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 禽流感病毒H_9N_2的增殖及血凝效价测定 |
| 1.2.2 rAAL作为灭活禽流感病毒H_9N_2佐剂的免疫程序 |
| 1.2.3 小鼠脾脏淋巴细胞分离 |
| 1.2.4 淋巴细胞计数 |
| 1.2.5 CCK-8检测小鼠脾脏淋巴细胞增殖能力 |
| 1.2.6 小鼠脾脏中CD4~+T、CD8~+T细胞数量及比例测定 |
| 1.2.7 免疫小鼠血清中H_9N_2的抗体水平检测 |
| 1.2.8 rAAL体外刺激小鼠脾脏淋巴细胞因子基因的转录 |
| 1.3 数据统计及分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 免疫小鼠血清中H_9N_2的抗体水平 |
| 2.2 免疫小鼠脾脏淋巴细胞体外增殖能力 |
| 2.3 免疫小鼠脾脏淋巴细胞中CD4~+T、CD8~+T细胞比例变化 |
| 2.4 rAAL体外刺激小鼠脾脏淋巴细胞因子的表达水平 |
| 3 讨论 |
| 3.1 rAAL作为灭活禽流感病毒H_9N_2佐剂的效果 |
| 3.2 rAAL对小鼠免疫反应的影响 |
| 3.2.1 rAAL增强小鼠的细胞免疫 |
| 3.2.2 rAAL促进小鼠脾脏淋巴细胞因子基因的表达量 |
| 本章小结 |
| 第三章 小鼠注射rAAL后脾脏转录组学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 试验动物 |
| 1.1.3 主要试剂和仪器 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 试验动物分组及免疫方案 |
| 1.2.2 免疫小鼠血清H_9N_2血凝抑制效价 |
| 1.2.3 免疫小鼠脾脏RNA提取 |
| 1.2.4 小鼠脾脏cDNA文库构建及测序 |
| 1.3 数据处理及分析方法 |
| 1.3.1 原始序列数据处理 |
| 1.3.2 序列比对 |
| 1.3.3 测序随机性分析及基因覆盖度统计 |
| 1.3.4 基因转录水平的统计计算 |
| 1.3.5 样品间差异表达基因分析(DEGs) |
| 1.3.6 GO功能富集分析 |
| 1.3.7 代谢通路(Pathway)富集分析 |
| 1.3.8 基因差异表达模式聚类分析 |
| 1.4 差异表达基因的qRT-PCR验证 |
| 1.4.1 验证的基因 |
| 1.4.2 qRT-PCR试验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 免疫小鼠血清H_9N_2的血凝抑制效价 |
| 2.2 各组样品RNA质量检测结果 |
| 2.3 各组样品测序后序列与小鼠基因组比对结果 |
| 2.4 差异表达基因分析 |
| 2.5 部分差异表达基因的qRT-PCR验证 |
| 2.5.1 rAAL组和control组10个基因的验证结果 |
| 2.5.2 H_9N_2+rAAL组和H_9N_2组10个基因的验证结果 |
| 2.6 差异基因的GO功能富集分析 |
| 2.6.1 Control-vs-rAAL差异基因GO生物功能富集分析 |
| 2.6.2 H_9N_2+rAAL-vs-H_9N_2差异基因GO生物功能富集分析 |
| 2.7 差异基因KEGGPathway富集分析 |
| 2.7.1 rAAL-vs-control差异基因Pathway富集分析 |
| 2.7.2 H_9N_2+rAAL组-vs-H_9N_2组差异基因Pathway富集分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 rAAL的佐剂效果 |
| 3.2 转录组测序结果的可靠性 |
| 3.3 rAAL促进造血干细胞的分化 |
| 3.4 rAAL促进中性粒细胞跨内皮迁移 |
| 3.4.1 rAAL增加IL-1β转录水平,增加白细胞数量 |
| 3.4.2 rAAL促进整合素和选择素基因表达量,启动白细胞迁移 |
| 3.4.3 rAAL促进趋化因子基因表达量,趋化中性粒细胞跨内皮迁移 |
| 3.5 rAAL与T细胞免疫、B细胞免疫 |
| 3.5.1 rAAL增加cfd基因表达,激活补体系统 |
| 3.5.2 rAAL促进T淋巴细胞分化 |
| 3.5.3 rAAL增强B淋巴细胞活化 |
| 本章小结 |
| 第四章 小鼠注射rAAL脾脏miRNA差异表达研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 试验动物 |
| 1.1.3 主要试验试剂 |
| 1.1.4 主要试验仪器 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 试验动物分组及免疫方案 |
| 1.2.2 免疫小鼠脾脏RNA提取 |
| 1.2.3 小鼠小RNA文库的构建及测序 |
| 1.3 数据处理及分析方法 |
| 1.3.1 原始数据处理 |
| 1.3.2 小RNA碱基偏向性和片段中碱基数目统计 |
| 1.3.3 不同样品间小RNA特有序列和公共序列 |
| 1.3.4 基因组比对 |
| 1.3.5 两样品间miRNA表达差异分析 |
| 1.3.6 miRNA靶基因的预测 |
| 1.3.7 GO富集分析 |
| 1.3.8 KEGG通路分析 |
| 1.4 差异表达的miRNA验证 |
| 1.4.1 试剂 |
| 1.4.2 qRT-PCR试验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 小鼠小RNA片段长度分布统计 |
| 2.1.1 小RNA片段的大小、数量统计 |
| 2.1.2 各处理组小RNA长度分布 |
| 2.1.3 差异表达的miRNAqRT-PCR验证结果 |
| 2.2 各组小RNA特有序列、公共序列 |
| 2.3 GenBank比对 |
| 2.3.1 Control组样品比对上GenBank中非编码的小RNA统计图 |
| 2.3.2 rAAL组样品比对上GenBank中非编码的小RNA统计图 |
| 2.3.3 H_9N_2组样品中比对上GenBank中非编码的小RNA统计图 |
| 2.3.4 H_9N_2+rAAL组比对上GenBank中非编码的小RNA统计图 |
| 2.4 Rfam比对 |
| 2.4.1 Control组比对上Rfam中非编码的小RNA统计图 |
| 2.4.2 rAAL组比对上Rfam中非编码的小RNA统计图 |
| 2.4.3 H_9N_2组比对上Rfam中非编码小RNA统计图 |
| 2.4.4 H_9N_2+rAAL组比对上Rfam非编码的小RNA统计 |
| 2.5 小RNA分类注释 |
| 2.5.1 Control组各类小RNA的分布 |
| 2.5.2 rAAL组各类小RNA的分布 |
| 2.5.3 H_9N_2组各类小RNA的分布 |
| 2.5.4 H_9N_2+rAAL组各类小RNA的分布 |
| 2.6 与已知miRNA数据库比对,构建小鼠脾脏miRNA表达谱 |
| 2.7 已知miRNA差异表达谱的分析 |
| 2.7.1 rAAL组与Control组差异表达miRNA |
| 2.7.2 H_9N_2+rAAL-vs-H_9N_2组差异表达miRNA |
| 2.7.3 rAAL-vs-H_9N_2组差异表达miRNA |
| 2.8 rAAL-vs-Control组已知差异表达miRNA的靶基因预测、GO富集分析和KEGG通路分析 |
| 2.9 H_9N_2+rAAL-vs-H_9N_2组已知差异表达miRNA的靶基因预测、GO富集分析和KEGG通路分析 |
| 2.10 rAAL处理与非rAAL处理小鼠脾脏差异表达的miRNA |
| 2.11 miR-124-3p和miR-3473e的靶基因预测和GO富集分析 |
| 2.11.1 miR-124-3p预测的靶基因 |
| 2.11.2 miR-3473e预测的靶基因 |
| 3 讨论 |
| 3.1 miRNA高通量测序结果的可靠性 |
| 3.2 rAAL组与Control组差异表达的miRNA分析 |
| 3.2.1 两组差异表达的miRNA数量 |
| 3.2.2 差异表达且被证实与免疫相关的miRNA分析 |
| 3.3 H_9N_2+rAAL组-vs-H_9N_2组差异表达的miRNA分析 |
| 3.3.1 两组差异表达的miRNA数量 |
| 3.3.2 差异表达且被证实与免疫相关的miRNA分析 |
| 3.4 miR-124-3p和miR-3473e靶基因预测 |
| 3.5 关于miR-124-3p靶基因GO富集和KEGG通路 |
| 3.6 关于miR-3473e靶基因GO富集和KEGG通路 |
| 本章小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 1 结论 |
| 2 创新与不足 |
| 2.1 创新 |
| 2.2 不足及后期工作 |
| 发表的文章 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）在一个巴基斯坦近亲结婚的家系中FANCM纯合移码突变导致男性不育的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 精子发生 |
| 1.2.1 生殖细胞命运决定 |
| 1.2.2 原始生殖细胞迁移和存活 |
| 1.2.3 性原细胞增殖、静息和迁移 |
| 1.2.4 精原细胞自我更新和分化 |
| 1.2.5 精母细胞减数分裂 |
| 1.2.6 精子形成 |
| 1.3 范可尼贫血与DNA链间交联修复 |
| 1.3.1 范可尼贫血 |
| 1.3.2 DNA链间交联产生原因和结果 |
| 1.3.3 FA通路与链间交联修复 |
| 1.3.4 FA通路的其他作用 |
| 1.3.5 FA通路与其他修复机制的交互作用 |
| 1.4 FANCM的功能 |
| 1.4.1 FANCM在FA通路的功能 |
| 1.4.2 FANCM的独特作用 |
| 1.4.3 FANCM与Bloom综合征的关系 |
| 1.4.4 FANCM激活DNA损伤检验点而不依赖FA通路 |
| 1.4.5 FANCM在复制叉重塑中的作用 |
| 第2章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 小鼠信息 |
| 2.1.2 细胞系及菌种 |
| 2.1.3 质粒载体 |
| 2.1.4 引物序列 |
| 2.1.5 抗体信息 |
| 2.1.6 耗材及试剂 |
| 2.1.7 实验仪器 |
| 2.1.8 溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 病例收集 |
| 2.2.2 全外显子组测序 |
| 2.2.3 外周血淋巴细胞培养及染色体断裂分析 |
| 2.2.4 质粒构建 |
| 2.2.5 细胞培养及转染 |
| 2.2.6 构建FANCM~(-/-)稳定的293T细胞系 |
| 2.2.7 外源导入FANCM回补内源FANCM敲除实验 |
| 2.2.8 免疫荧光 |
| 2.2.9 Western Blot |
| 2.2.10 RNA抽提 |
| 2.2.11 RT-PCR |
| 2.2.12 基因敲除小鼠制备 |
| 2.2.13 小鼠生育力检测 |
| 2.2.14 睾丸组织包埋及切片 |
| 2.2.15 组织切片苏木精伊红染色(HE) |
| 2.2.16 组织切片免疫荧光染色 |
| 2.2.17 小鼠精母细胞铺展及染色 |
| 2.2.18 BrdU染色 |
| 2.2.19 TUNEL检测 |
| 2.2.20 精子计数 |
| 2.2.21 精原细胞中期染色体断裂分析 |
| 2.2.22 统计学分析 |
| 第3章 实验结果及讨论 |
| 3.1 实验结果 |
| 3.1.1 巴基斯坦近亲结婚家系中男性不育的临床表型 |
| 3.1.2 巴基斯坦家系不育患者中筛选并确定FANCM纯合移码突变 |
| 3.1.3 FANCM突变导致患者染色体断裂修复缺陷但不导致骨髓衰竭 |
| 3.1.4 FANCM突变功能缺失损害FA通路 |
| 3.1.5 FANCM突变降低细胞存活率 |
| 3.1.6 Fancm~(△~C/△~C)小鼠无骨髓衰竭 |
| 3.1.7 Fancm~(△~C/△~C)雄性小鼠生育力降低 |
| 3.1.8 Fancm~(△~C/△~C)雄性小鼠精子发生异常 |
| 3.1.9 Fancm~(△~C/△~C)雄性小鼠出生前后生殖细胞增殖减少 |
| 3.1.10 FANCM突变与精子变形阶段DNA断裂修复 |
| 3.2 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间的主要学习成果 |
| 致谢 |
| 附录1 预测突变的有害性的软件列表 |
（8）LAG3参与小鼠急性肺损伤炎症消退及其可能机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 小鼠急性肺损伤炎症消退过程中肺内免疫细胞计数的动态变化及淋巴细胞表面LAG3表达 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分LAG3基因敲除小鼠急性肺损伤炎症消退进程的改变 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 在读期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（9）鸡蛋胆固醇营养效果及其脂质调控成分筛选与机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 鸡蛋中胆固醇的存在形式与类型 |
| 2 胆固醇小肠吸收的遗传调控 |
| 2.1 胆固醇小肠吸收的生理过程 |
| 2.2 胆固醇小肠吸收效率的遗传因素变异 |
| 2.3 胆固醇小肠吸收效率的影响因素 |
| 2.4 胆固醇小肠吸收效率的测定 |
| 3 胆固醇细胞代谢的遗传调控 |
| 3.1 胆固醇生物合成 |
| 3.2 胆固醇动态平衡的转录调控 |
| 3.3 胆固醇酯化及胆固醇酯的水解 |
| 3.4 胆固醇代谢产物 |
| 3.4.1 胆汁酸 |
| 3.4.2 羟化固醇衍生物 |
| 3.4.3 类固醇激素 |
| 4 鸡蛋摄取与血胆固醇的关系 |
| 4.1 胆固醇饮食-心血管疾病假说的提出 |
| 4.2 鸡蛋胆固醇营养作用争议的产生与持续 |
| 4.3 鸡蛋胆固醇营养作用争议产生后的新发现 |
| 5 鸡蛋中调控胆固醇吸收代谢的成分 |
| 5.1 鸡蛋中的蛋白质与氨基酸 |
| 5.1.1 鸡蛋中个别氨基酸影响胆固醇代谢 |
| 5.1.2 鸡蛋蛋白质对体内胆固醇合成代谢的影响 |
| 5.2 蛋黄中的脂质与脂蛋白 |
| 5.2.1 蛋黄中不饱和脂肪酸的协调作用 |
| 5.2.2 叶黄素的抗氧化作用 |
| 5.2.3 蛋黄中的脂蛋白 |
| 5.3 蛋黄中的磷脂 |
| 5.3.1 过量磷脂干扰微胶束中磷脂的有效水解 |
| 5.3.2 过量磷脂改变混合微胶束的物理化学性质 |
| 5.3.3 磷脂直接作用于肠上皮细胞的胆固醇吸收转运 |
| 5.4 鸡蛋整体摄入影响LDL类型的转变 |
| 5.5 其他因素 |
| 6 展望 |
| 7 选题学术思想 |
| 7.1 研究目的和意义 |
| 7.2 学术思路 |
| 7.3 研究路线 |
| 7.4 主要研究内容 |
| 7.4.1 鸡蛋胆固醇营养效果及主要代谢途径实验动物学研究 |
| 7.4.2 鸡蛋中调控胆固醇吸收代谢成分的找寻研究 |
| 7.4.3 鸡蛋脂质成分对胆固醇吸收代谢调控机理的研究 |
| 第二章 鸡蛋摄取对大鼠血脂水平及肝脏胆固醇代谢相关基因表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 原料 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器与设备 |
| 1.1.4 缓冲溶液配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 实验设计 |
| 1.2.2 各组大鼠饲料的制备与营养成分的测定 |
| 1.2.3 大鼠样品采集与处理 |
| 1.2.4 大鼠摄食量、体重及脏器比值的测定 |
| 1.2.5 大鼠肝脏、血液及粪便生化指标的测定 |
| 1.2.6 大鼠肝组织与胸主动脉病理学检查 |
| 1.2.7 大鼠肝胆固醇代谢相关基因mRNA表达量的测定 |
| 1.2.8 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 各组大鼠饲料的营养成分比较 |
| 2.2 各组大鼠摄食量、体重变化及脏器比值变化 |
| 2.3 各组大鼠血脂、肝脂及粪脂水平变化 |
| 2.3.1 各组大鼠血脂水平变化 |
| 2.3.2 各组大鼠肝脂水平变化 |
| 2.3.3 各组大鼠粪脂水平变化 |
| 2.4 各组大鼠肝组织病理学变化 |
| 2.4.1 各组大鼠肝实图 |
| 2.4.2 各组大鼠肝HE切片图 |
| 2.5 大鼠肝胆固醇代谢相关基因mRNA表达量的变化 |
| 2.5.1 大鼠肝脏总RNA质量评价与RT-qPCR退火条件的优化 |
| 2.5.2 各组大鼠肝脏胆固醇代谢基因mRNA表达量的变化 |
| 2.6 鸡蛋摄入对健康SD大鼠肝脏胆固醇代谢通路的影响 |
| 3 小结 |
| 第三章 Caco-2细胞单层模型的建立与评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 Caco-2细胞株 |
| 1.1.2 主要试剂与耗材 |
| 1.1.3 主要仪器与设备 |
| 1.1.4 缓冲溶液配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 Caco-2细胞培养 |
| 1.2.2 Caco-2细胞单层模型的建立 |
| 1.2.3 Caco-2细胞生长曲线的制备 |
| 1.2.4 Caco-2细胞单层模型紧密性与完整性的鉴定 |
| 1.2.5 Caco-2细胞单层模型形态学观察 |
| 1.2.6 Caco-2细胞生长分化特征的鉴定 |
| 1.2.7 Caco-2细胞单层通透性的验证 |
| 1.2.8 数据处理与统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Caco-2细胞生长曲线 |
| 2.1.1 接种浓度的选择 |
| 2.1.2 不同时间段Caco-2细胞生长情况 |
| 2.2 Caco-2细胞单层模型的紧密性与完整性 |
| 2.3 Caco-2细胞单层模型的形态学观察 |
| 2.4 Caco-2细胞单层模型的极化 |
| 2.5 荧光黄转运实验 |
| 2.6 Caco-2细胞单层模型的建立与转运实验注意事项 |
| 3 小结 |
| 第四章 胆固醇在Caco-2细胞单层模型中的体外转运研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 Caco-2细胞株 |
| 1.1.2 主要试剂与耗材 |
| 1.1.3 主要仪器与设备 |
| 1.1.4 缓冲溶液配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 Caco-2细胞单层模型的建立与验证 |
| 1.2.2 3H-胆固醇的测定 |
| 1.2.3 不同pH值下Caco-2细胞单层模型中的胆固醇转运实验 |
| 1.2.4 不同浓度下Caco-2细胞单层模型中的胆固醇转运实验 |
| 1.2.5 Ezetimibe添加后Caco-2细胞单层模型中的胆固醇转运实验 |
| 1.2.6 RT-qPCR实验 |
| 1.2.7 Western-blot实验 |
| 1.2.8 数据处理与统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Caco-2细胞单层模型的验证 |
| 2.2 pH对胆固醇在Caco-2细胞单层模型转运的影响 |
| 2.3 浓度对胆固醇Caco-2细胞单层模型转运的影响 |
| 2.4 Eetimibe对胆固醇Caco-2细胞单层模型转运的影响 |
| 2.5 Ezetimibe对胆固醇吸收关键蛋白NPC1L1表达的影响 |
| 2.6 胆固醇在Caco-2细胞单层模型中转运类型的鉴定 |
| 3 小结 |
| 第五章 鸡蛋中调控Caco-2细胞胆固醇吸收转运成分的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 Caco-2细胞株 |
| 1.1.2 主要试剂与耗材 |
| 1.1.3 主要仪器与设备 |
| 1.1.4 缓冲溶液配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 鸡蛋蛋白质的提取 |
| 1.2.2 鸡蛋蛋白质的体外胃肠模拟消化 |
| 1.2.3 鸡蛋候选因子的理化特性鉴定 |
| 1.2.4 候选因子对Caco-2细胞的毒性试验 |
| 1.2.5 鸡蛋各候选因子在Caco-2细胞单层模型中的摄取方案 |
| 1.2.6 鸡蛋各候选因子在Caco-2细胞单层模型中的转运方案 |
| 1.2.7 数据处理与统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Caco-2细胞单层模型的验证 |
| 2.2 鸡蛋蛋白与磷脂的理化特性分析 |
| 2.3 鸡蛋候选因子对Caco-2细胞的毒性试验 |
| 2.4 鸡蛋中候选因子对Caco-2细胞单层中胆固醇摄取的影响 |
| 2.5 鸡蛋中候选因子对Caco-2细胞单层中胆固醇转运的影响 |
| 2.6 鸡蛋中调控胆固醇在Caco-2单层模型中转运的成分 |
| 3 小结 |
| 第六章 磷脂对胆固醇微胶束物理化学性质的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂与耗材 |
| 1.1.2 主要仪器与设备 |
| 1.1.3 缓冲溶液配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 微胶束化学成分分析 |
| 1.2.2 牛磺胆酸钠结合能力测定 |
| 1.2.3 胆固醇的溶解度测定 |
| 1.2.4 牛磺胆酸盐的溶解度测定 |
| 1.2.5 微胶束的分子量变化测定 |
| 1.2.6 数据处理与统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 微胶束化学成分分析 |
| 2.2 磷脂对其与牛磺胆酸钠结合能力的影响 |
| 2.3 磷脂对盐溶液中胆固醇溶解度的影响 |
| 2.4 磷脂对盐溶液中牛磺胆酸盐溶解度的影响 |
| 2.5 磷脂对微胶束分子量变化的影响 |
| 2.6 鸡蛋中磷脂对胆固醇微胶束物理化学性质的影响 |
| 3 小结 |
| 第七章 鸡蛋卵磷脂与神经鞘磷脂调控Caco-2细胞胆固醇吸收转运的分子机理研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 Caco-2细胞株 |
| 1.1.2 主要试剂与耗材 |
| 1.1.3 主要仪器与设备 |
| 1.1.4 缓冲溶液配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 Caco-2细胞单层模型的建立 |
| 1.2.2 磷脂脂肪酸的氧化与细胞毒性实验 |
| 1.2.3 鸡蛋卵磷脂与神经鞘磷脂在Caco-2细胞中的孵育 |
| 1.2.4 Caco-2细胞总RNA提取与RT-qPCR反应 |
| 1.2.5 Western-blot实验 |
| 1.2.6 数据处理与统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 磷脂脂肪酸氧化性与毒性评价 |
| 2.2 Caco-2细胞总RNA质量评价与RT-qPCR退火条件的优化 |
| 2.3 Caco-2细胞中胆固醇转运蛋白NPC1L1翻译与转录水平的变化 |
| 2.4 Caco-2细胞中胆固醇吸收代谢相关基因mRNA表达量的变化 |
| 2.4.1 Caco-2细胞中ABCG5与ABCG8 mRNA转录水平的变化情况 |
| 2.4.2 Caco-2细胞中ABCA1 mRNA转录水平的变化情况 |
| 2.4.3 Caco-2细胞中ACAT2与MTP mRNA转录水平的变化情况 |
| 2.4.4 Caco-2细胞中Caveolin 1与Annexin A2 mRNA转录水平的变化情况 |
| 2.4.5 Caco-2细胞中SREBP-1与SREBP-2 mRNA转录水平的变化情况 |
| 2.5 磷脂孵育后对Caco-2细胞中胆固醇吸收代谢通路的影响 |
| 3 小结 |
| 第八章 鸡蛋脂肪酸调控Caco-2细胞胆固醇吸收转运的分子机理研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 Caco-2细胞株 |
| 1.1.2 主要试剂与耗材 |
| 1.1.3 主要仪器与设备 |
| 1.1.4 缓冲溶液配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 Caco-2细胞单层模型的建立 |
| 1.2.2 鸡蛋脂肪酸的氧化与细胞毒性实验 |
| 1.2.3 鸡蛋脂肪酸在Caco-2细胞中的孵育 |
| 1.2.4 Caco-2细胞总RNA提取与RT-qPCR反应 |
| 1.2.5 Western-blot实验 |
| 1.2.6 数据处理与统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 脂肪酸氧化性与毒性评价 |
| 2.2 Caco-2细胞中胆固醇转运蛋白NPC1L1翻译与转录水平的变化 |
| 2.3 Caco-2细胞中胆固醇吸收代谢相关基因mRNA转录水平的变化 |
| 2.3.1 Caco-2细胞中ABCG5与ABCG8 mRNA转录水平的变化情况 |
| 2.3.2 Caco-2细胞中ABCA1 mRNA转录水平的变化情况 |
| 2.3.3 Caco-2细胞中ACAT2与MTP mRNA转录水平的变化情况 |
| 2.3.4 Caco-2细胞中Caveolin 1与Annexin A2 mRNA转录水平的变化情况 |
| 2.3.5 Caco-2细胞中SREBP-1与SREBP-2 mRNA转录水平的变化情况 |
| 2.4 脂肪酸孵育后对Caco-2细胞中胆固醇吸收代谢通路的影响 |
| 3 小结 |
| 第九章 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 创新性 |
| 3 延续研究计划 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、维生素A从循环向组织转运存在多种途径（论文参考文献）
- [1]基于TLR4/NF-κB通路探讨SDR9C7基因在急性肺损伤模型中作用机制[D]. 贺思诺. 广西师范大学, 2021(09)
- [2]超重、肥胖儿童血清微量营养素水平分析[D]. 冯佳宾. 沈阳医学院, 2021(10)
- [3]抑制自噬诱导肿瘤相关巨噬细胞复极化和增强喉癌细胞对顺铂的化学敏感性[D]. 郭颖. 山东大学, 2020(10)
- [4]基于肝脏微环境因素的肝纤维化的致病机理和干预策略研究[D]. 职晓松. 中国人民解放军海军军医大学, 2019(10)
- [5]23-乙酰泽泻醇B抑制IgE/Ag介导的肥大细胞的激活和过敏反应[D]. 邵晨. 天津医科大学, 2019(02)
- [6]重组杨树菇凝集素（rAAL）的佐剂效应及机理研究[D]. 马立保. 华中农业大学, 2018(01)
- [7]在一个巴基斯坦近亲结婚的家系中FANCM纯合移码突变导致男性不育的研究[D]. 殷浩. 中国科学技术大学, 2018(10)
- [8]LAG3参与小鼠急性肺损伤炎症消退及其可能机制研究[D]. 黎娜. 第二军医大学, 2016(11)
- [9]鸡蛋胆固醇营养效果及其脂质调控成分筛选与机理研究[D]. 杨芳. 华中农业大学, 2013(01)
- [10]玻璃体内注射型缓释微粒给药系统的研究进展[J]. 王建欣,杨继章. 河北医科大学学报, 2011(03)